Plataforma de vectores lentivirales para la entrega eficiente de las herramientas de edición de epigenoma en humanos inducida por modelos de enfermedad derivados de células madre pluripotentes

Múltiples plataformas de edición de epigenoma han desarrollado recientemente para cualquier secuencia de ADN en las regiones que controlan la expresión de gene^1,2. Las herramientas de edición de epigenoma creadas están diseñadas para (i) regular la transcripción, (ii) alterar modificaciones post-traduccionales de las histonas, (iii) modificar la metilación del ADN y (iv) modular las interacciones del elemento regulador. El enfoque para la fijación de los modificadores de la transcripción de la cromatina a un Cas9 desactivados (muertos) (dCas9) levantado de previamente desarrolladas plataformas de edición de epigenoma, como zinc dedo de proteínas (ZFPs) y efectores como activador de transcripción (cuentos), albergar un dominio potente efector transcripcional (ED) fusionados con el diseño dominio DNA-que atan (DBD)³. Los resultados del fenotipo deseado como activación o represión es definido por la molécula efectora anclada a los loci endógenos (figura 1). Para crear activadores transcripcionales programables, dCas9/gRNA módulos están vinculados con VP16^4,5,6 (figura 1A), un dominio de activación viral que recluta Pol II y la maquinaria de transcripción general. La modificación de este sistema ha incluido VP64, un tetrámero de dominios VP16, proporcionando una activación más robusto tipo^5,6. El sistema ha sido empleado con éxito para activar regiones de codificación y los dirigidos a promotores y elementos reguladores. Lo importante es que, aunque las moléculas VP64 no modifican directamente la estructura de la cromatina en la región de destino, recluta a modificadores de la cromatina que se unen los resultados en la deposición de las marcas activa (eucromatina), como la acetilación de H3/H4 y H3 K4 di / Tri-metilación^5,6. Además VP64, la subunidad p65 del humano complejo NF-kB ha sido anclada a la dCas9/gRNA módulo⁷. Curiosamente, la inmovilización de estos efectores a las regiones corriente arriba de los sitios de inicio de transcripción (TSSs) a promotores da como resultado una inducción del gen fuerte. Sin embargo, efectores VP64 y p65 también pueden ejercer efectos activatory al ser enlazadas a las regiones ubicadas aguas abajo de TSSs y potenciadores distal^7,8. Para provocar una respuesta transcripcional más robusta, múltiples fusiones VP64 dCas9 o dCas9-p65 deben reclutarse a un solo objetivo locus^9,10. Así, el reciente desarrollo de próxima generación activadores, que contratar varios dominios efector por un complejo dCas9-gRNA sola, como SunTag, ha dado como resultado una capacidad de activación más fuerte comparación con dCas9-VP64 de contrapartes fusion^{11 , 12}. una mejor activación transcripcional ha sido obtenida mediante la fusión de VP64, p65 y Rta (VPR), un dominio de transactivación de gamma-herpesvirus, el C-terminal de dCas9¹³ (figura 1A). Sistemas similares de CRISPR/dCas9 se han desarrollado para la represión de destino específico (figura 1B).

Represión del gen endógeno puede lograrse con fusiones de represor dirigido a través de una variedad de mecanismos (figura 1B). Se ha demostrado que CRISPR/dCas9 sistemas, relacionados con el represor DBD (incluso sin un dominio efector/s), eficaz pueden silenciar genes mientras que atado a un promotor o upstream, downstream-TSS regiones^{3,6 ,14}. Los efectos sobre la transcripción es causada por la interferencia estérica de unión del factor de transcripción y el procesamiento de ARN polimerasa. Sin embargo, se necesitan enfoques más integrales, como represión génica por impedimento estérico sola a menudo no es suficiente para silenciar robusto. El reciente desarrollo de la próxima generación de silenciadores basados en sistemas de CRISPR/dCas9 con dominios represor transcripcional (TRD), modificadores de la histona (H3-K9 di-/ tri-metilación, H3-K27 di-/ tri-metilación; H3-K36 di-/ tri-metilación, desacetilación H3/H4) y la metilación del ADN (GPC) dirigida a la construcción de herramientas epigenéticas permitiendo más robusto silenciamiento efectos^{4,5,15,16, 17,18,19,20}. Se ha demostrado que el reclutamiento de estos modificadores epigenéticos en el ADN puede conducir a la formación de cromatina más condensada y cerrada, que normalmente generan un silenciamiento más potente resultado^21,22. El dominio silenciamiento más comúnmente utilizado con DBD es la caja asociada a Krüppel (Cascarudo)^4,5. La contratación del factor se ha demostrado para corresponder con los cambios de la cromatina; sin embargo, los mecanismos de estas modificaciones deben ser elucidadas^16,17,18. Recientemente, se ha demostrado que la localización de KRAB al ADN puede promover al montaje de la histona metiltransferasa SETDB1 y los complejos de NuRD histona desacetilación (HDAC), sugiriendo la posibilidad de que estas interacciones median la formación de condensación de la cromatina y silenciamiento transcripcional del^3,13. Como un enfoque alternativo, los dominios efectores se pueden fusionar a DBD para crear una proteína silenciamiento epigenética personalizada. Este sistema cataliza directamente represivas marcas de ADN o modificaciones de las histonas.

Recientemente, el uso de sistemas CRISPR/dCas9 sintéticos anclada a la enzima DNMT3A ha sido repurposed para desactivación transcripcional. DNMT3A cataliza la metilación del ADN que ejerce represión transcripcional durante la formación de la heterocromatina en promotores de genes endógenos y otras regiones reguladoras (figura 1B)^18,20. McDonald et al.¹⁸ y²⁰ de Vojta et al fueron los primeros autores para informar que la metilación del ADN puede utilizarse para silenciamiento de epigenoma o represión, demostrando que el sistema de fusión de plásmido-entrega dCas9-DNMT3A potentemente puede mejorar metilación de la citosina en el TSS^18,20. McDonald ‘ s y compañeros de trabajo demostraron que el empleo de la estrategia puede resultar en una reducción significativa (alrededor del 40%) en un gen supresor de tumores, los niveles de mRNA de CDKN2A ¹⁸. Del mismo modo, dirigida a la región unmethylated promotor de los genes de BACH o IL6ST muestra mayor metilación CpG que se ha correlacionado con una reducción de doble en la expresión génica del²⁰. Nuestro laboratorio recientemente ha reutilizar el uso de la metilación del ADN para atenuar los resultados patológicos de SNCA sobreexpresión (figura 2)²³. La estrategia se basa en la mejora selectiva en la metilación del ADN en la región del intrón 1 de SNCA , como fue divulgado previamente para ser hypomethylated en EP y demencia de Lewy (DLB) los cuerpos cerebros^{24,25, 26}. Esta hipometilación se ha relacionado con sobreexpresión del SNCA , ofreciendo así un atractivo objetivo para la intervención terapéutica^24,27,28. Nos recientemente mostró un bajo nivel de metilación del ADN en el intrón 1 del SNCA región en NPCs dopaminérgico derivado hiPSC Obtenido de un paciente de PD con el SNCA la triplicación de la²³. La ventaja de este modelo experimental es que los PNJs pueden ser propagados enérgicamente en la cultura o más diferenciados en neuronas maduras, lo que permite una prueba eficiente identificar factores genéticos que median en fenotipos celulares, incluyendo oxidativo estrés y apoptosis²⁹. Además, este modelo de sistema permite a los científicos a recapitular los acontecimientos del desarrollo que ocurrieron antes de la aparición de los síntomas en los pacientes. Además, NPCs hiPSC derivados representan una gran herramienta para poner a prueba las vías celulares y moleculares asociadas con la expresión génica. Lo importante, NPCs hiPSC derivados combinados con tecnología CRISPR/Cas9-epigenoma pueden facilitan enormemente el desarrollo de “drogas de última generación” para muchas enfermedades neurodegenerativas.

Para reducir niveles patológicos de expresión SNCA, recientemente desarrollamos un lentivirus sistema basado en que una proteína de fusión dCas9-DNMT3A y gRNA a específicamente la metilación CpG objetivo dentro del SNCA intrón 1 (figura 2A)²³. Este protocolo describe vectores lentivirales (LV) diseño y producción en detalle. LVs representan un medio eficaz de ofrecer componentes CRISPR/dCas9 por varias razones, a saber: (i) su capacidad para llevar la DNA voluminoso inserciones, (ii) una alta eficiencia de transducción de una amplia gama de células, incluyendo células divisorias y nondividing³⁰ y (iii) su capacidad para inducir respuestas inmunogénicas y citotóxicas mínima. Recientemente, aplicó el sistema del LV a neuronas dopaminérgicas hiPSC derivado de un paciente con la triplicación del lugar geométrico del SNCA y demostró el potencial terapéutico de LVs para la entrega de la edición de epigenoma metilación herramientas²³ ( Figura 2B). De hecho, un sistema del LV-gRNA/dCas9-DNMT3A causa un aumento significativo en la metilación del ADN en la región del intrón 1 del SNCA . Este aumento se corresponde con la reducción de los niveles de mRNA y proteína SNCA ²³. Por otra parte, downregulation del SNCA rescata fenotipos relacionados con la PD en el SNCA triplicación/hiPSC-derivado dopaminérgico neuronas (p. ej., mitocondrial ROS producción celular viabilidad y)²³. Importante aún, hemos demostrado que la reducción en la expresión de SNCA por el sistema del LV-gRNA-dCas9-DMNT3A es capaz de revertir los fenotipos característicos de neuronas dopaminérgicas hiPSC derivado de un paciente de PD que llevó a la SNCA triplicación, como ROS mitocondriales producción y célula viabilidad²³. El objetivo de este protocolo es 1) para indicar el protocolo de producción y concentración de una plataforma de LV optimizada para generar alta cuchicheaba preparaciones virales y 2) para describir la diferenciación de hiPSCs en NPCs con motivos para ser dopaminérgico maduro las neuronas^31,32 y la caracterización de los niveles de metilación de la región específica dentro del SNCA intrón 1.

Lentivirales plataformas tienen una gran ventaja sobre la plataforma más popular de vector, es decir, adeno-asociado vectores (AAVs), que es la capacidad del primero para dar cabida a grandes inserciones genética^33,34. Aireación puede generarse rendimientos significativamente más altos pero poseen una capacidad de envasado bajo (< 4,8 kb), comprometer su uso para la entrega de sistemas de CRISPR/Cas9 all-in-one. Así pues, parece que el LVs sería la plataforma de elección en las aplicaciones involucradas en la entrega de herramientas CRISPR/dCas9. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí será una herramienta valiosa para los investigadores que deseen entregar eficazmente epigenoma edición componentes a las células y órganos. El protocolo adicional describe la estrategia para aumentar las capacidades de producción y expresión de los vectores a través de una modificación en cis de los elementos en el vector expresión cassette^30,35. La estrategia se basa en la novela el sistema desarrollado y estudiado en nuestro laboratorio y destaca su habilidad para producir partículas virales en el rango de 10¹⁰ unidades virales (VU) / ml^30,35.