Лентивирусные вектор платформа для эффективной доставки Epigenome-инструменты для редактирования в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток болезни моделей

Epigenome редактирования платформ недавно была разработана для любых последовательностей ДНК в регионах, которые контролируют ген выражение^1,2. Созданные инструменты редактирования epigenome предназначены для (i) регулируют транскрипцию, (ii) изменять Посттрансляционная гистона модификации, (iii) изменения метилирования и (iv) модулировать регуляторные элементы взаимодействия. Подход к якорь транскрипция/хроматина модификаторы списанного (мертвый) Cas9 (dCas9) поднял из ранее развитых epigenome редактирования платформ, таких как цинк палец белки (ZFPs) и транскрипции активатор как эффекторов (сказки), укрывательство мощным transcriptional эффекторных домен (Эд) сливается с дизайном ДНК связывающий домен (DBD)³. Результаты желаемого фенотип, такие как активация или репрессий определяется эффекторные молекулы, привязанный к эндогенной локусов (рис. 1). Для создания программируемой transcriptional активаторы, dCas9/gRNA модули связаны с VP16^4,5,6 (рис. 1а), вирусные активации домена, новобранцев Pol II и механизмы общего транскрипции. Модификации этой системы включает VP64, Тетрамер VP16 доменов, обеспечивая еще более надежной активации ставка^5,6. Система успешно работает для того чтобы активировать кодирования и некодирующей регионов путем промоутеров и нормативных элементов. Важно отметить, что даже несмотря на то, что VP64 молекулы изменить структуру хроматина в целевом регионе непосредственно, он новобранцев хроматина модификаторы, которые связывают результаты осаждения активный (euchromatin) знаков, включая как H3/H4 ацетилирования и H3-K4 di / Tri метилирования^5,6. В дополнение к VP64 субъединица p65 человека NF-κB комплекса были привязаны к dCas9/gRNA модуль⁷. Интересно привязывая Эти эффекторы в регионы вверх по течению транскрипции начала сайтов (тссс) и в пределах промоутеров приводит к сильным гена индукции. Тем не менее VP64 и p65 эффекторов можно также оказывают activatory эффекты во время связаны с регионов, расположенных ниже по течению, ТССС и дистальной усилители^7,8. Для получения более надежной транскрипционный анализ ответа, несколько dCas9-VP64 или dCas9-p65 сплавливания нужно набираться для одной цели Локус^9,10. Таким образом недавнее развитие активаторы следующего поколения, которые набору несколько доменов эффекторных одного dCas9-gRNA комплексом, таких как SunTag, привело к сильной активации возможности по сравнению с dCas9-VP64 фьюжн партнерам^{11 , 12}. Улучшение transcriptional активации были получены через слияние VP64, Р65 и Rta (VPR), transactivation домена от гамма Герпесвирусы, C-конечная dCas9¹³ (рис. 1A). Подобные системы ТРИФОСФАТЫ/dCas9 были разработаны для конкретных целевых объектов репрессий (рис. 1B).

Эндогенные гена репрессий с инженерии репрессор сплавливания можно добиться различных механизмов (рис. 1B). Было продемонстрировано, что ТРИФОСФАТЫ/dCas9 систем, связанных с репрессор DBD (даже без домена эффекторных/s), можно эффективно замолчать экспрессии генов в то время как привязанный к промоутер или вверх/вниз по течению TSS регионы^{3,6 ,14}. Влияние на транскрипции обусловлено их пространственной помех привязки фактор транскрипции и обработки РНК-полимеразы. Тем не менее необходимы более всеобъемлющие подходы, как ген репрессии их пространственной помех только часто не достаточно для надежной глушителей. Последние разработки следующего поколения глушители на основе ТРИФОСФАТЫ/dCas9 систем перевозящих transcriptional репрессор домены (TRDs), модификаторы гистонов (H3-K9 ди-/ tri метилирования, H3-K27 ди-/ tri метилирования; H3-K36 ди-/ tri метилирования, H3/H4 диацетилморфина) и привело к строительству эпигеномные инструментов, позволяя более надежной, глушителей эффекты^{4,5,,1516, метилирование ДНК (CpG) 17,18,19,20}. Было продемонстрировано, что набор эти эпигеномные модификаторов для ДНК может привести к формированию более закрытой и конденсированных хроматина, который обычно генерируют более мощным глушителей исход^21,22. Наиболее часто глушителей домен, используется с DBDs — это связанные Krüppel box (краб)^4,5. Набор фактора была продемонстрирована в соответствие с изменениями chromatin; Тем не менее механизмы этих изменений еще не должны быть проясненного^16,17,18. Недавно было показано, что локализация краб ДНК может содействовать Ассамблея метилтрансфераза гистона SETDB1 и гистонов диацетилморфина (HDAC) NuRD комплексов, предлагая возможность того, что эти взаимодействия посредником формирования конденсацию хроматина и transcriptional глушителей^3,13. В качестве альтернативного подхода эффекторные домены можно сливается с DBDs для создания пользовательских эпигеномные глушителей белка. Эта система непосредственно катализирует репрессивных ДНК знаки или изменения гистона.

Недавно использование синтетических ТРИФОСФАТЫ/dCas9 систем, привязанный к DNMT3A фермента был многоцелевых transcriptional дезактивации. DNMT3A катализирует метилирование ДНК, которая оказывает транскрипционный анализ репрессий на протяжении формирования гетерохроматин эндогенного генным стимуляторам и других регулирующих регионов (рис. 1B)^18,20. McDonald et al.¹⁸ и войта et al.²⁰ были первые авторы сообщить что метилирование ДНК может использоваться для epigenome-генов или репрессий, демонстрируя, что доставлено плазмида dCas9-DNMT3A системы фьюжн мощно может повысить метилирование цитозина вокруг^18,ТП²⁰. Макдональд и coworkers продемонстрировал, что занятости стратегия может привести к значительному сокращению (около 40%) в опухоль супрессирующем Гене CDKN2A мРНК уровнях¹⁸. Аналогичным образом ориентация региона unmethylated промоутера генов, Бах или IL6ST показывает увеличение метилирования CpG, что был коррелирует с сокращением вдвое выражение гена²⁰. Наша лаборатория недавно многоцелевых использование метилирование ДНК для ослабления патологических результатов SNCA гиперэкспрессия (рис. 2)²³. Стратегия основана на избирательное повышение метилирование ДНК в регионе Интрон 1 SNCA , как ранее сообщалось, чтобы быть hypomethylated в PD и деменции с Леви органов (ДЛБ) мозги^{24,25, 26}. Этот hypomethylation связан с SNCA гиперэкспрессия, таким образом предлагая привлекательной мишенью для терапевтического вмешательства^24,27,28. Недавно мы показали низкий уровень метилирования ДНК в SNCA Интрон 1 региона в hiPSC производные дофаминергической НИПы, полученную от PD пациента с SNCA постулатов²³. Преимуществом этой экспериментальной модели является что NPC может быть надежно распространен в культуре или далее дифференцированной в зрелых нейронов, позволяя эффективный скрининг для выявления генетических факторов, которые посредником сотовой фенотипов, включая окислительного стресс и апоптоз²⁹. Кроме того эта модель система позволяет ученым охарактеризовать развития событий, которые произошли до появления симптомов у больных. Кроме того hiPSC производные НИПы представляют собой прекрасный инструмент для тестирования клеточном и молекулярном пути, связанные с выражением генов. Важно отметить, что hiPSC производные НПС, в сочетании с технологией ТРИФОСФАТЫ/Cas9-epigenome искусство может значительно облегчить развитие «next-generation наркотиков» для многих нейродегенеративных заболеваний.

Чтобы уменьшить патологического уровня SNCA выражение, мы недавно разработали системы, основанной на человека, dCas9-DNMT3A синтез белка и gRNA специально целевой метилирования CpG внутри SNCA Интрон 1 (рисунок 2A)²³. Этот протокол будет описывать лентивирусные вектор (LV) проектирование и производство в деталях. LVs являются эффективным средством доставки компонентов ТРИФОСФАТЫ/dCas9 по нескольким причинам, а именно: (i) их способности выполнять громоздкие ДНК вставляет, (ii) высокой эффективности преобразователя широкий спектр клеток, включая клетки деления и nondividing³⁰ и (iii) их способность вызывать минимальное цитотоксических и иммуногенные ответы. Недавно мы обратились LV системы hiPSC производные дофаминергические нейроны от пациента с постулатов Локус SNCA и продемонстрировал терапевтический потенциал LVs для доставки epigenome редактирования метилирования инструменты²³ ( Рисунок 2B). Действительно LV-gRNA/dCas9-DNMT3A системы вызывает значительное увеличение метилирование ДНК в регионе Интрон 1 SNCA . Этот рост соответствует снижением уровня мРНК и белка SNCA ²³. Кроме того SNCA Даунрегуляция спасает PD-связанных фенотипы в SNCA постулатов/hiPSC производные дофаминергических нейронов (например, митохондриальной ROS производства и клеток жизнеспособности)²³. Важно отметить, что мы показали, что сокращение в выражении SNCA LV-gRNA-dCas9-DMNT3A системы способны обратить вспять фенотипов, которые характерны для hiPSC производные дофаминергические нейроны от PD пациента, который нес SNCA постулатов, например митохондриальной ROS производства и клеток жизнеспособности²³. Целью настоящего Протокола является 1) чтобы наметить протокол производства и концентрации LV платформу для создания высокой tittered вирусных препаратов и 2) описывают дифференцирование hiPSCs в NPC, рисунком стать зрелой дофаминергической нейроны^31,32 и характеристика уровень метилирования целевого региона в рамках SNCA Интрон 1.

Лентивирусные платформы имеют значительное преимущество над самой популярной платформы вектор, а именно аденоассоциированный векторов (AAVs), который является бывший возможность разместить большие генетические вставки^33,34. AAVs могут быть собраны в значительно более высокие урожаи, но обладают низким упаковки емкостью (< 4.8 КБ), ущерба для их использования для доставки все-в-одном ТРИФОСФАТЫ/Cas9 систем. Таким образом оно кажется, что рН будет выбор платформы приложений, участвующих в доставке ТРИФОСФАТЫ/dCas9 инструментов. Таким образом протокол, изложенные здесь будет ценным инструментом для исследователей, желающих эффективно передавать epigenome редактирования компонентов клеток и органов. Протокол также излагается стратегия для увеличения производства и выражения возможности векторов через изменения в СНГ элементов в вектор выражения кассеты^30,35. Стратегия основана на романе система разработана и учился в нашей лаборатории и подчеркивается его способность производить вирусных частиц в диапазоне 10¹⁰ вирусных единиц (VU) / мл^30,35.