JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

Published: March 29, 2019
doi:
10.3791/59241
, , , , , , , ,
1Department of Neurology,Duke University Medical Center, 2Center for Genomic and Computational Biology,Duke University Medical Center, 3Viral Vector Core,Duke University Medical Center, 4Division of Gynecologic Oncology, Department of Obstetrics and Gynecology,Duke University Medical Center

Summary

לפלח epigenome DNA עריכה מייצג גישה טיפולית רב-עוצמה. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, טיהור, הריכוז של ה-all-in-one וקטורים lentiviral מסתירים את transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A עבור יישומים לעריכת epigenome בתא גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSC)-נגזר נוירונים.

Abstract

השימוש של תאים hiPSC, נגזר מייצג בגישה יקר ללמוד מחלות ניווניות אנושי. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ממוטב עבור הבידול של hiPSCs נגזר מטופל עם triplication של אלפא-synuclein ג’ין (SNCA) מיקומה לתוך מחלת פרקינסון (PD)-אוכלוסיות עצביים וכולינרגיים הרלוונטיים. לצבירת ראיות הראה כי רמות גבוהות של SNCA הם סיבתי לפיתוח של הכרה PD. קליניות צריכים לייסד רומן גישות טיפוליות עבור PD, במיוחד אלה מיקוד ברגולציה של ביטוי SNCA , אנחנו לאחרונה פיתחה מערכת CRISPR/dCas9-מתילציה-מבוסס DNA epigenetically לווסת שעתוק SNCA על ידי העשרת רמות מתילציה האזור רגולטוריות אינטרון 1 SNCA . כדי לספק את המערכת, המורכב מת (שהפעלתם בוטלה) הגירסה של Cas9 (dCas9) התמזגו עם המחשבים קטליטי של 3A אנזים methyltransferase ה-DNA (DNMT3A), וקטור lentiviral משמש. מערכת זו חלה על תאים המכילים triplication של לוקוס SNCA ומקטין את SNCA-mRNA ואת רמות החלבון בכ 30% באמצעות מתילציה DNA יישוב של אינטרון SNCA 1. Downregulation מכויל של רמות SNCA מציל הקשורים למחלות פנוטיפים הסלולר. בפרוטוקול הנוכחי, אנו שואפים לתאר את הליך שלב אחר שלב עבור המבדילים hiPSCs לתוך ובתאים עצבית (NPCs) ואת הממסד אימות של מבחני pyrosequencing על ההערכה של הפרופיל מתילציה SNCA אינטרון 1. חלוקה לרמות ביתר פירוט את המערכת lentivirus-CRISPR/dCas9 שימוש בניסויים אלה, פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר ולטהר, להתרכז וקטורים lentiviral כדי לסמן להתאמתם עבור epigenome ואת הגנום-יישומים לעריכת באמצעות hiPSCs ו- NPCs. הפרוטוקול ניתנת להתאמה בקלות והוא יכול לשמש כדי לייצר כייל נוגדנים גבוה lentiviruses ליישומים במבחנה ויוו.

Introduction

פלטפורמות מרובות לעריכת epigenome פותחו לאחרונה להתמקד על כל רצפי DNA אזורים ששולטים ג’ין ביטוי1,2. הכלים לעריכת epigenome שנוצר מתוכננים (i) להסדיר שעתוק, (ii) לשנות שינוי היסטון posttranslational, (iii) לשנות מתילציה DNA, (iv) לווסת את רכיב אינטראקציות. הגישה כדי לעגן את מכפילי תמלול/כרומטין Cas9 (מת) שהפעלתם בוטלה (dCas9) מופעל מבעבר מפותח לעריכת epigenome פלטפורמות, כגון אבץ אצבע חלבונים (ZFPs) ו effectors כמו מפעיל שעתוק (אגדות), מחסה תחום אפקטור תעתיק חזק (אד) התמזגו לתחום ה-DNA מחייב מעוצב (DBD)3. התוצאות של פנוטיפ הרצויה כגון הפעלה או דיכוי מוגדרת על-ידי המולקולה אפקטור מעוגנת את לוקוסים אנדוגני (איור 1). כדי ליצור activators תעתיק לתכנות, dCas9/gRNA מודולים מקושרים VP164,5,6 (איור 1 א’), תחום הפעלה ויראלי מגייס Pol II והמנגנון שעתוק כללי. השינוי של מערכת זו כללה VP64, tetramer של תחומים VP16, מתן אפילו יותר חזקה הפעלת קצב5,6. המערכת כבר מועסקים בהצלחה להפעיל קידוד ואזורים noncoding על ידי מיקוד היזמים ואלמנטים רגולטוריות. חשוב, אף-על-פי מולקולות VP64 ישירות אל תשנה את הכרומטין באזור היעד, היא מגייסת מכפילי כרומטין אשר מאגד תוצאות בעדות של הסימנים פעיל (euchromatin), כולל acetylation H3/H4, H3-K4 di / tri-מתילציה5,6. בנוסף VP64, יחידת משנה p65 של המתחם NF-κB האנושי יש כבר קשור את מודול dCas9/gRNA7. מעניין, קשירה של אלה effectors לאזורים במעלה הזרם של שעתוק התחלה אתרים (אזעקת דייט) ובתוך היזמים תוצאות אינדוקציה גנים חזקים. למרות זאת, effectors VP64 ו p65 שיכולים להפעיל גם את ההשפעות activatory תוך כדי להיות מקושר לאזורים ממוקם במורד הזרם של אזעקת דייט, משפרי דיסטלי7,8. כדי מביאות לתגובה תעתיק עמיד יותר, מספר dCas9-VP64 או dCas9-p65 fusions צריך להתגייס על יעד בודד לוקוס9,10. ככזה, ההתפתחות האחרונה של מפעילים הדור הבא, אשר לגייס תחומים אפקטור מרובים על-ידי מורכבת dCas9 יחיד-gRNA, כגון SunTag, הביא חזק הפעלה יכולת השוואה בין dCas9-VP64 פיוז’ן עמיתיהם11 , 12. תעתיק הפעלה משופרת התקבל באמצעות היתוך גרעיני של VP64, p65 Rta (VPR), transactivation לתחום של גמא-herpesviruses, קצה קרבוקסילי של dCas913 (איור 1 א’). מערכות CRISPR/dCas9 דומות התפתחו במטרה הדיכוי (איור 1B).

ג’ין אנדוגני דיכוי יכולה להיות מושגת עם fusions מדכא. שבולם שעברו הנדסה לאחור באמצעות מגוון רחב של מנגנונים (איור 1B). הוכח כי מערכות CRISPR/dCas9, לקשר את מדכא. שבולם DBD (אפילו בלי אפקטור תחום/s), ביעילות תסתמי כבר ביטוי גנים בעוד קשור יזם או נגד הזרם/במורד הזרם-TSS אזורים3,6 ,14. ההשפעות על שעתוק נגרמת על ידי הפרעה הסטריים של איגוד פקטור שעתוק ועיבוד RNA פולימראז. עם זאת, גישות מקיף יותר נדרשים, כמו ג’ין דיכוי מאת לבד הסטריים מכשלה הוא לעתים קרובות לא מספיק בשביל להשתיק חזקים. ההתפתחות האחרונה של הדור הבא של משתיקי קול בהתבסס על מערכות CRISPR/dCas9 נושא מדכא. שבולם תעתיק תחומים (TRDs), מכפילי היסטון (H3-K9 di-/ tri-מתילציה, H3-K27 di-/ tri-מתילציה; H3-K36 di-/ tri-מתילציה, H3/H4 deacetylation), ואת מתילציה DNA (CpG) הוביל את בניית כלים epigenetic ומאפשר עמידים יותר להשתיק אפקטים4,5,15,16, 17,18,19,20. זה הוכח, כי הגיוס של אלה epigenetic מכפילי ה-DNA עשוי להוביל להיווצרות עוד כרומטין סגור, והם מרוכז, אשר בדרך כלל להפיק יותר חזק שתיקה התוצאה21,22. התחום שתיקה הנפוץ ביותר בשימוש עם DBDs הוא4,Krüppel-הקשורים תיבת (קראב)5. הגיוס של הגורם הוכח כדי להתכתב עם כרומטין השינויים; ובכל זאת, המנגנון של שינויים אלה הם עדיין להיות מבואר16,17,18. לאחרונה, הוכח כי הלוקליזציה של קראב ל- DNA יכול לקדם את מכלול של methyltransferase היסטון את SETDB1, את מתחמי NuRD deacetylation (HDAC) היסטון, מציעה את האפשרות כי אינטראקציות אלה לתווך את היווצרות עיבוי כרומטין, תעתיק שתיקה3,13. כגישה חלופית, אפקטור תחומים יכול להיות דבוקה DBDs ליצירת חלבון שתיקה epigenetic מותאם אישית. מערכת זו מזרז ישירות דכאניים סימוני הדנ א או שינויים היסטון.

לאחרונה, השימוש במערכות CRISPR/dCas9 סינתטי קשור האנזים DNMT3A יש כבר לשנות את ייעודו עבור הביטול תעתיק. DNMT3A מזרז מתילציה DNA זה מפעילה דיכוי גנים ברמת השעתוק במהלך היווצרות של הטרוכרומטין על היזמים ג’ין אנדוגני, אחרים אזורים רגולטוריות (איור 1B)18,20. מקדונלד ואח18 ו- Vojta et al.20 היו המחברים הראשונים לדווח על כך שניתן להשתמש מתילציה DNA epigenome-ג’ין להחרשת או דיכוי, הממחיש המערכת פיוז’ן המועבר פלסמיד dCas9-DNMT3A יכול לשפר מנע בעוצמה ציטוזין מתילציה סביב ה TSS18,20. מקדונלד ועמיתים הפגינו התעסוקה של האסטרטגיה עלולה לגרום לירידה משמעותית (כ-40%) בגן מדכאי, רמות ה-mRNA CDKN2A 18. באופן דומה, פילוח האזור מקדם unmethylated של גנים באך או IL6ST מראה מתילציה CpG מוגבר זה היה בקורלציה עם הפחתה כפולה של ביטוי גנים20. המעבדה שלנו יש לאחרונה לשנות את ייעודו השימוש מתילציה DNA attenuating התוצאה פתולוגית של SNCA ביטוי (איור 2)23. האסטרטגיה מבוססת על שיפור סלקטיבי מתילציה DNA בתוך אזור אינטרון 1 SNCA , כפי שדווח בעבר להיות hypomethylated PD, דמנציה עם לוי גופים (DLB) המוח24,25, 26. Hypomethylation זה נקשר ביטוי SNCA , ובכך מציעים ליעד אטרקטיבי עבור התערבות טיפולית24,27,28. אנחנו לאחרונה הראו רמה נמוכה של מתילציה DNA אינטרון SNCA 1, אזור hiPSC, נגזר וכולינרגיים NPCs המתקבל מטופל PD עם triplication SNCA 23. היתרון של מודל ניסיוני זה היא כי NPCs ניתן robustly מופצות בתרבות או נוסף הבדיל לתוך נוירונים בוגרים, הפעלת של סינון יעיל לזהות גורמים גנטיים המתווכות פנוטיפים הסלולר, כולל חמצוני מתח, אפופטוזיס29. יתר על כן, מערכת מודל זה מאפשר למדענים לסכם את האירועים התפתחותית זו לפני תחילת סימפטום בחולים. בנוסף, נגזר hiPSC NPCs מייצגים כלי נהדר כדי לבדוק את המסלולים תאית ומולקולרית המשויך ביטוי גנים. חשוב, NPCs נגזר hiPSC, בשילוב עם טכנולוגיית CRISPR/Cas9-epigenome המדינה-of-the-art יכול מאוד להקל על הפיתוח של “הדור הבא סמים” למחלות ניווניות רבות.

כדי להפחית את רמות פתולוגי של ביטוי SNCA, שפיתחנו לאחרונה מערכת מבוססת lentivirus נושא של חלבון כימרי dCas9-DNMT3A ו- gRNA כדי במיוחד היעד מתילציה CpG בתוך אינטרון SNCA 1 (איור 2 א)23. פרוטוקול זה יתאר וקטור lentiviral (LV) עיצוב וייצור בפירוט. הזינו אותו מייצגים אמצעי יעיל להעברת רכיבים CRISPR/dCas9 מכמה סיבות, כלומר מוסיף (i) את יכולת לשאת DNA מגושם, (ii) יעילות גבוהה של מגוון רחב של תאים, כולל תאים החלוקה והן nondividing30 transducing , וכן (iii) את היכולת שלהם זירוז תגובות ציטוטוקסיות ו immunogenic מינימלי. לאחרונה, אנחנו שהוחל מערכת LV נוירונים דופאמין hiPSC, נגזר מן המטופל עם triplication של מיקומה SNCA והפגינו את הפוטנציאל הטיפולי של אותו למסירה של עריכת epigenome מתילציה כלים23 ( איור 2B). ואכן, מערכת LV-gRNA/dCas9-DNMT3A גורמת עלייה משמעותית מתילציה DNA-האזור אינטרון 1 SNCA . גידול זה מתכתב עם הירידה ברמות של mRNA, חלבון SNCA 23. יתר על כן, SNCA downregulation מציל הקשורות PD פנוטיפים ב- SNCA triplication/hiPSC-derived וכולינרגיים נוירונים (למשל, מיטוכונדריאלי ROS ייצור ותא הכדאיות)23. חשוב לציין, הפגנו כי ההפחתה בביטוי SNCA על ידי מערכת LV-gRNA-dCas9-DMNT3A הוא מסוגל היפוך על הפנוטיפים האופייניים של נוירונים דופאמין hiPSC, נגזר מן המטופל PD שביצע את SNCA triplication, כגון מיטוכונדריאלי ROS ייצור ותא הכדאיות23. המטרה של פרוטוקול זה הוא 1) כדי לחלק לרמות הפרוטוקול של הפקה וריכוז של פלטפורמת LV ממוטב ליצירה צייץ בשיא ההכנות נגיפי ו 2) כדי לתאר את הבידול של hiPSCs לתוך NPCs בדוגמת להפוך וכולינרגיים בוגרת נוירונים31,32 , אפיון רמות מתילציה של האזור יישוב בתוך אינטרון SNCA 1.

פלטפורמות lentiviral יש יתרון גדול על פלטפורמת וקטור הפופולרי ביותר, כלומר adeno-הקשורים וקטורים (AAVs), אשר הוא היכולת של לשעבר להכיל מוסיף גנטי גדול33,34. AAVs ניתן ליצור תשואות גבוהות באופן משמעותי, אבל בעלי קיבולת אריזה נמוך (< 4.8 kb), להתפשר על השימוש בהם לצורך אספקת מערכות CRISPR/Cas9 ה-all-in-one. לפיכך, נראה כי אותו יהיה הפלטפורמה-של-הבחירה ביישומי מעורב אספקה של כלים CRISPR/dCas9. לכן, פרוטוקול שמפורטות כאן יהיה כלי רב ערך עבור חוקרים שרוצים להעביר ביעילות רכיבים לעריכת epigenome תאים ואיברים. פי הפרוטוקול, מתאר את האסטרטגיה כדי להגדיל את יכולות הייצור וביטוי של הווקטורים באמצעות שינוי ב- cis הרכיבים בתוך30,35קלטת ביטוי וקטור. האסטרטגיה מבוססת על הרומן מערכת שפותחה למד במעבדה שלנו ואני מדגיש את היכולת שלה לייצר חלקיקים נגיפיים בטווח של 1010 יחידות ויראלי (וו) /mL30,35.

Protocol

1. מערכת העיצוב והייצור וירוס פלסמיד עיצוב ובנייההערה: הבנייה של וקטור LV-gRNA-dCas9-DNMT3A ה-all-in-one מתבצע באמצעות הפקה- ואת קלטת ביטוי ממוטב ביטוי שפורסמו על-ידי Ortinski et al.30. בקלטת וקטור נושא שידור חוזר של האתר זיהוי של גורם שעתוק Sp1 ומחיקה של המדינה-of-the-art בתוך לא…

Representative Results

אימות של titers הייצור של הווקטורים LV-dCas9-DNMT3A-GFP/פורו בהשוואה לכנף GFP תמים אנו לבצע p24מחסום פה אליסה כדי להשוות בין titers הפיזי של LV-dCas9-DNMT3A-GFP/פורו עם עמיתיהם GFP/פורו תמימה. התוצאות נציג, המוצגים באיור 5A, מדגימים כי ה?…

Discussion

הזינו אותו החלו להסתמן כמו הרכב של epigenome עריכה, במיוחד בהקשר של מחלות גנטיות, בעיקר בגלל היכולת שלהם (i) להכיל מטענים דנ א גדולים ו- (ii) מגלי ביעילות מגוון רחב של חלוקת תאים nondividing. היעילות אריזה גדולה של אותו מועיל במיוחד עבור יישומים הכוללים אריזות של מערכות CRISPR/dCas9 אשר גדולות מדי. מנקודת מבט ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו הייתה מומן בחלקו על ידי בפרס הפיתוח Neurotechnology קאהן (כדי האו. סי) ואת נבחרת מוסדות של בריאות/לאומי המכון של הפרעות נוירולוגיות שבץ (NIH/NINDS) (NS085011 R01 כדי האו. סי).

Materials

Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
6-well plates Corning 3516
Aggrewell 800 StemCell Technologies 34811
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
BD FACS Becton Dickinson 338960
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
Eppendorf Cell Imaging Slides Eppendorf 30742060
High-binding 96-well plates Corning 3366
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Reversible Strainer StemCell Technologies 27215
SW32Ti rotor Beckman Coulter 369650
VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic VWR 93000-694
VWR® Vacuum Filtration Systems VWR 89220-694
xMark™ Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
Accutase StemCell Technologies 7920
Anti-Adherence Rinsing Solution StemCell Technologies 7010
Anti-FOXA2 Antibody Abcam Ab60721
Anti-Nestin Antibody Abcam Ab18102
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587010
BES Sigma Aldrich B9879 – BES
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260037
CHIR99021 StemCell Technologies 72052
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning 08-774-552
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
DMEM-F12 Lonza 12-719
DMEM, high glucose media Gibco 11965
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
EpiTect PCR Control DNA Set Qiagen 596945
EZ DNA Methylation Kit Zymo Research D5001
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15750078
Gentle Cell Dissociation Reagent stemCell Technologies 7174
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Human Recombinant bFGF StemCell Technologies 78003
Human Recombinant EGF StemCell Technologies 78006
Human Recombinant Shh (C24II) StemCell Technologies 78065
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140050
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502001
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103049
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
PyroMark PCR Kit Qiagen 978703
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
SB431542 StemCell Technologies 72232
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
STEMdiff Neural Induction Medium StemCell Technologies 5835
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium StemCell Technologies 5838
TaqMan Assay FOXA2 Thermo Fisher Scientific Hs00232764
TaqMan Assay GAPDH Thermo Fisher Scientific Hs99999905
TaqMan Assay Nestin Thermo Fisher Scientific Hs04187831
TaqMan Assay OCT4 Thermo Fisher Scientific Hs04260367
TaqMan Assay PPIA Thermo Fisher Scientific Hs99999904
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
Y27632 StemCell Technologies 72302
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pMD2.G Addgene 12253
pRSV-Rev Addgene 52961
psPAX2 Addgene 12259
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsmBI New England Biolabs R0580S
BsrGI New England Biolabs R0575S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Thakore, P. I., Black, J. B., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Editing the epigenome: technologies for programmable transcription and epigenetic modulation. Nature Methods. 13 (2), 127-137 (2016).
  4. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  5. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  6. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  7. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  8. Horlbeck, M. A., et al. Nucleosomes impede Cas9 access to DNA in vivo and in vitro. eLife. 5, (2016).
  9. Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
  10. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
  11. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  12. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  13. Holtzman, L., Gersbach, C. A. Editing the Epigenome: Reshaping the Genomic Landscape. Annual Review of Genomics and Human Genetics. , (2018).
  14. Perez-Pinera, P., et al. Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors. Nature Methods. 10 (3), 239-242 (2013).
  15. Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nature Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).
  16. Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).
  17. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  18. McDonald, J. I., et al. Reprogrammable CRISPR/Cas9-based system for inducing site-specific DNA methylation. Biology Open. 5 (6), 866-874 (2016).
  19. Huang, Y. H., et al. DNA epigenome editing using CRISPR-Cas SunTag-directed DNMT3A. Genome Biology. 18 (1), 176 (2017).
  20. Vojta, A., et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5615-5628 (2016).
  21. Razin, A., Kantor, B. DNA methylation in epigenetic control of gene expression. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 38, 151-167 (2005).
  22. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18786-18791 (2009).
  23. Kantor, B., et al. Downregulation of SNCA Expression by Targeted Editing of DNA Methylation: A Potential Strategy for Precision Therapy in PD. Molecular Therapy. , (2018).
  24. Jowaed, A., Schmitt, I., Kaut, O., Wullner, U. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson’s disease patients’ brains. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6355-6359 (2010).
  25. Wang, Y., et al. A DNA methyltransferase inhibitor, 5-aza-2′-deoxycytidine, exacerbates neurotoxicity and upregulates Parkinson’s disease-related genes in dopaminergic neurons. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (3), 183-190 (2013).
  26. Matsumoto, L., et al. CpG demethylation enhances alpha-synuclein expression and affects the pathogenesis of Parkinson’s disease. PLOS One. 5 (11), e15522 (2010).
  27. Desplats, P., et al. Alpha-synuclein sequesters Dnmt1 from the nucleus: a novel mechanism for epigenetic alterations in Lewy body diseases. Journal of Biological Chemistry. 286 (11), 9031-9037 (2011).
  28. Ai, S. X., et al. Hypomethylation of SNCA in blood of patients with sporadic Parkinson’s disease. Journal of the Neurological Sciences. 337 (1-2), 123-128 (2014).
  29. Tagliafierro, L., Chiba-Falek, O. Up-regulation of SNCA gene expression: implications to synucleinopathies. Neurogenetics. 17 (3), 145-157 (2016).
  30. Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 5, 153-164 (2017).
  31. Tagliafierro, L., et al. Genetic analysis of alpha-synuclein 3′ untranslated region and its corresponding microRNAs in relation to Parkinson’s disease compared to dementia with Lewy bodies. Alzheimer’s & Dementia. 13 (11), 1237-1250 (2017).
  32. Tagliafierro, L., Zamora, M. E., Chiba-Falek, O. Multiplication of the SNCA locus exacerbates neuronal nuclear aging. Human Molecular Genetics. , (2018).
  33. Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical applications involving CNS gene transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
  34. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
  35. Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56915 (2017).
  36. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 16 (12), 1968-1976 (2008).
  37. Bassil, C. F., Huang, Z., Murphy, S. K. Bisulfite pyrosequencing. Methods in Molecular Biology. 1049, 95-107 (2013).
  38. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Research. 43 (13), 6450-6458 (2015).
  39. Nishimasu, H., et al. Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9. Cell. 162 (5), 1113-1126 (2015).
  40. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  41. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. Journal of Virology. 68 (4), 2632-2648 (1994).
  42. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. Journal of Virology. 71 (8), 6113-6127 (1997).
  43. Goffin, V., et al. Transcription factor binding sites in the pol gene intragenic regulatory region of HIV-1 are important for virus infectivity. Nucleic Acids Research. 33 (13), 4285-4310 (2005).
  44. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21545-21552 (2005).
  45. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 19 (3), 547-556 (2011).

Tags

Lentiviral VectorEpigenome EditingHuman Induced Pluripotent Stem CellsDisease ModelsCRISPR/CasAlpha-synucleinGene ExpressionGuide RNAMolecular CloningPlasmid ConstructionNeural Progenitor CellsDNA Methyltransferase (DNMT3A)

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tagliafierro, L., Ilich, E., Moncalvo, M., Gu, J., Sriskanda, A., Grenier, C., Murphy, S. K., Chiba-Falek, O., Kantor, B. Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models. J. Vis. Exp. (145), e59241, doi:10.3791/59241 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image