Vetor de Lentivirus de plataforma para a entrega eficiente de ferramentas de edição de Epigenoma em humanos induzida por modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes

Múltiplas plataformas Epigenoma-edição foram recentemente desenvolvidas para direcionar as sequências de DNA nas regiões que controlam a expressão de gene^1,2. As ferramentas de edição Epigenoma criadas destinam-se a (i) regulam a transcrição, (ii) alterar modificações do histone posttranslational, (iii) modificar a metilação do DNA e (iv) modular interações elemento regulamentar. A abordagem para ancorar os modificadores de transcrição/cromatina para um Cas9 (morto) desativado (dCas9) ressuscitou anteriormente desenvolvidas Epigenoma-edição plataformas, tais como zinco dedo proteínas (ZFPs) e efetores, como ativador de transcrição (contos), abrigando um domínio efetor transcriptional potente (ED) fundido ao domínio de ligação a DNA projetado (DBD)³. Os resultados do fenótipo desejado como ativação ou repressão é definida pela molécula efetora ancorada ao Locus endógenos (Figura 1). Para criar ativadores transcricionais programáveis, dCas9/gRNA módulos estão ligados à VP16^4,5,6 (figura 1A), um domínio de ativação viral que recrutas Pol II e a maquinaria de transcrição geral. A modificação deste sistema incluiu VP64, um tetrâmero de domínios VP16, fornecendo um ainda mais robusta^5,taxa de ativação⁶. O sistema tem sido empregado com sucesso para ativar regiões não-codificadoras e codificação, orientando os promotores e dos elementos reguladores. Importante, mesmo que VP64 moléculas diretamente não modifique a estrutura da cromatina na região de destino, ele recruta modificadores de cromatina, que se ligam os resultados no depoimento das marcas ativo (eucromatina), incluindo como acetilação H3/H4 e H3-K4 di / Tri-metilação^5,6. Além de VP64, a subunidade p65 do NF-κB humano complexo tem sido amarrada ao dCas9/gRNA módulo⁷. Curiosamente, o tethering desses efetores às regiões montante dos locais de início da transcrição (TSSs) e dentro de promotores resulta em uma indução do gene forte. No entanto, VP64 e p65 efetores também podem exercer os efeitos activatory enquanto ser linkadas para as regiões situadas a jusante de TSSs e no distal potenciadores de^7,8. Para eliciar uma resposta transcricional mais robusta, várias fusões de dCas9-VP64 ou dCas9-p65 deveriam ser recrutados para um destino único locus^9,10. Como tal, o desenvolvimento recente de ativadores de próxima geração, que recrutar vários domínios efetoras por um complexo único dCas9-gRNA, tais como SunTag, resultou em uma capacidade de ativação mais forte comparando com dCas9-VP64 fusão homólogos^{11 , 12}. uma ativação transcricional melhorada foi obtida através da fusão de VP64, p65 e Rta (VPR), um domínio do transactivation do gama-herpesviruses, para o C-terminal da dCas9¹³ (figura 1A). Desenvolveram-se sistemas semelhantes de CRISPR/dCas9 para a repressão de destino específico (figura 1B).

Repressão do gene endógeno pode ser conseguido com fusões repressor projetadas através de uma variedade de mecanismos (figura 1B). Foi demonstrado que sistemas CRISPR/dCas9, ligados ao repressor DBD (mesmo sem um domínio efetor/s), com eficiência podem silenciar a expressão de gene, enquanto amarrados a um promotor ou montante/jusante-TSS regiões^{3,6 ,14}. Os efeitos na transcrição é causado por interferência estérica de ligação do fator de transcrição e processamento de RNA polimerase. No entanto, são necessárias abordagens mais abrangentes, como repressão do gene por estérico sozinho muitas vezes não é suficiente para silenciar robusto. O recente desenvolvimento da próxima geração de silenciadores baseado em sistemas CRISPR/dCas9 carregando domínios transcricional repressor (TRDs), modificadores de histona (H3-K9 di-/ tri-metilação, H3-K27 di-/ tri-metilação; H3-K36 di-/ tri-metilação, deacetilação de histona H3/H4) e metilação de DNA (CpG), levado à construção de ferramentas epigenéticas, permitindo mais robusto silenciar efeitos^{4,5,15,16, 17,18,19,20}. Foi demonstrado que o recrutamento desses modificadores epigenéticas ao DNA pode levar à formação de cromatina mais condensada e fechada, que normalmente geram um mais potente silencioso resultado^21,22. O domínio de silenciar mais comumente usado com DBDs é o caixa Krüppel-associado (CASCUDO)^4,5. O recrutamento do fator foi demonstrado para corresponder com as alterações da cromatina; no entanto, os mecanismos destas modificações são ainda ser elucidado^16,17,18. Recentemente, tem sido demonstrado que a localização do Siri CASCUDO para DNA pode promover a montagem do methyltransferase do histone SETDB1 e os complexos de NuRD histona deacetilação (HDAC), sugerindo a possibilidade de que estas interações mediam a formação de condensação da cromatina e transcriptional silencioso^3,13. Como uma abordagem alternativa, domínios effector podem ser fundidos a DBDs para criar uma proteína de silenciamento epigenética personalizada. Este sistema diretamente catalisa repressivas marcas de DNA ou modificações do histone.

Recentemente, a utilização de sistemas CRISPR/dCas9 sintéticos amarrados à enzima DNMT3A tem foi realocada para desativação transcricional. Dnmt3a catalisa a metilação do DNA que exerce repressão transcriptional em toda a formação de heterocromatina em promotores de genes endógenos e outras regiões reguladoras (figura 1B)^18,20. McDonald et al.¹⁸ e Vojta et al²⁰ foram os primeiros autores para relatar que a metilação do DNA pode ser usada para Epigenoma-silenciamento ou repressão, demonstrando que o sistema de fusão de dCas9-DNMT3A entregue em plasmídeo potente pode melhorar metilação de citosina em torno do TSS^18,20. McDonald ‘ s e colegas demonstraram que o emprego da estratégia pode resultar em uma redução significativa (cerca de 40%) em um gene supressor de tumor, os níveis de mRNA de CDKN2A ¹⁸. Da mesma forma, visando a região unmethylated promotor dos genes BACH ou IL6ST mostra aumentada metilação de CpG que tem sido correlacionada com a expressão de gene²⁰redução dupla. Nosso laboratório tem recentemente realocado o uso de metilação do DNA para atenuar os resultados patológicos de SNCA superexpressão (Figura 2)²³. A estratégia baseia-se na seletiva do realce na metilação do DNA dentro da região de intron 1 SNCA , como anteriormente foi relatado para ser hypomethylated em PD e demência com Lewy (DLB) de corpos cérebros^{24,25, 26}. Esta hypomethylation tem sido associada a SNCA superexpressão, oferecendo assim um alvo atraente para a intervenção terapêutica de^27,24,28. Recentemente mostramos um baixo nível de metilação do DNA na SNCA intron 1 na região de hiPSC-derivado dopaminérgico NPCs obtidos de um paciente de PD com o SNCA triplicação²³. A vantagem deste modelo experimental é que os NPCs podem ser robustamente propagados na cultura ou ainda mais diferenciados em neurônios maduros, permitindo uma triagem eficiente identificar fatores genéticos que medeiam fenótipos celulares, incluindo oxidativo stress e apoptose²⁹. Além disso, este modelo sistema permite aos cientistas recapitular os eventos do desenvolvimento que ocorreram antes do aparecimento de sintomas em pacientes. Além disso, hiPSC-derivado de NPCs representam uma ótima ferramenta para testar as vias celulares e moleculares associadas a expressão gênica. Importante, NPCs derivado de hiPSC, combinados com estado-da-arte tecnologia CRISPR/Cas9-Epigenoma podem facilitar muito o desenvolvimento de “drogas de última geração” para muitas doenças neurodegenerativas.

Para reduzir níveis patológicos de expressão SNCA, recentemente desenvolvemos um sistema baseado em lentivirus carregando uma proteína de fusão de dCas9-DNMT3A e gRNA para especificamente alvo CpG do methylation dentro o SNCA intron 1 (Figura 2A)²³. Este protocolo irá descrever design vetor de Lentivirus (LV) e produção em detalhe. VLS representam um meio eficaz de fornecer componentes CRISPR/dCas9 por várias razões, nomeadamente (i) sua capacidade de transportar DNA volumoso insere, (ii) uma alta eficiência de transducing uma ampla variedade de células, incluindo células de divisão e nondividing³⁰ e (iii) sua habilidade de induzir respostas imunogênicas e citotóxicas mínimas. Recentemente, aplicamos o sistema LV para os neurônios dopaminérgicos hiPSC-derivado de um paciente com a triplicação do locus a SNCA e demonstrou o potencial terapêutico de LVs para a entrega da edição de Epigenoma metilação ferramentas²³ ( Figura 2B). Com efeito, um sistema de LV-gRNA/dCas9-DNMT3A ocasiona um aumento significativo na metilação do DNA na região do intron 1 SNCA . Este aumento corresponde com a redução dos níveis de SNCA mRNA e proteína²³. Além disso, a SNCA downregulation resgata fenótipos relacionados com PD na SNCA triplicação/hiPSC-derivado dopaminérgico neurônios (por exemplo, mitocondrial ROS produção e célula viabilidade)²³. Importante, temos demonstrado que a redução na expressão SNCA pelo sistema LV-gRNA-dCas9-DMNT3A é capaz de reverter os fenótipos que são característicos para os neurônios dopaminérgicos hiPSC-derivado de um paciente de PD que carregava a SNCA triplicação, tais como mitocondrial ROS produção e célula viabilidade²³. O objetivo do presente protocolo é 1) para delinear o protocolo de produção e concentração de uma plataforma otimizada de LV para gerar alta-tittered virais preparações e 2) para descrever a diferenciação de hiPSCs em NPCs padronizada para tornar-se maduro dopaminergic os neurônios^31,32 e a caracterização dos níveis de metilação da região alvo dentro SNCA intron 1.

Particulas de Lentivirus plataformas tem uma grande vantagem sobre a plataforma mais popular do vetor, ou seja adeno-associado vetores (AAVs), que é capacidade a ex de acomodar maior inserções genética^33,34. AAVs podem ser gerados em rendimentos significativamente mais elevados, mas possuem uma capacidade baixa de empacotamento (< 4,8 kb), comprometer a sua utilização para fornecimento de sistemas de CRISPR/Cas9 all-in-one. Assim, parece que o LVs seria a plataforma de escolha nas aplicações envolvidas no fornecimento de ferramentas CRISPR/dCas9. Portanto, o protocolo descrito aqui vai ser uma ferramenta valiosa para pesquisadores desejando entregar efetivamente Epigenoma-editando componentes para as células e órgãos. O protocolo mais descreve a estratégia para aumentar as capacidades de produção e expressão dos vetores através de uma modificação na CEI dos elementos dentro do vetor expressão gaveta^30,35. A estratégia é baseada no romance o sistema desenvolvido e estudado em nosso laboratório e destaca sua capacidade de produzir partículas virais no intervalo de 10¹⁰ unidades virais (VU) /mL^30,35.