منهاج متجه لينتيفيرال الكفاءة في تقديم أدوات تحرير ابيجينومي إلى الإنسان الناجمة عن نماذج المرض المستمدة من الخلايا الجذعية Pluripotent

تم وضع منصات متعددة تحرير epigenome مؤخرا لاستهداف أي تسلسل الحمض النووي في المناطق التي تتحكم في الجينات التعبير^1،2. صممت أدوات تحرير epigenome الذي تم إنشاؤه ل (ط) تنظيم النسخ و (ثانيا) تغيير التعديلات هيستون بوستترانسلاشونال، (ثالثا) تعديل مثلايشن الحمض النووي و (رابعا) تعدل التفاعلات العنصر التنظيمي. النهج لربط معدلات النسخ/الكروماتين إلى Cas9 (ميتا) المعطلة (dCas9) التي أثيرت من قبل منصات التحرير epigenome المتقدمة، مثل الزنك الإصبع البروتينات (زفبس) والنسخ الشبيهة بالمنشط المستجيبة (حكايات)، إيواء مجال المستجيب النسخي قوية تنصهر (ED) إلى مجال الحمض النووي ملزم المصممة (DBD)³. ويعرف نتائج النمط الظاهري المطلوب مثل التنشيط أو القمع الجزيء المستجيب ترتكز المكاني الذاتية (الشكل 1). لإنشاء وسائل تفعيل الترانسكربتي القابلة للبرمجة، ترتبط وحدات dCas9/جرنا VP16^4،،من⁵⁶ (الشكل 1A)، مجال تنشيط فيروسية المجندين “بول الثاني” وآلات النسخ العام. وشمل تعديل هذا النظام VP64، تيترامير VP16 المجالات، توفير إطار حتى أكثر قوة تفعيل^5،معدل⁶. وقد استخدمت بنجاح النظام لتنشيط مناطق الترميز وفضله باستهداف العناصر التنظيمية والمروجين. الأهم من ذلك، على الرغم من أن الجزيئات VP64 مباشرة لا تقم بتعديل هيكل الكروماتين في المنطقة المستهدفة، من المجندين المعدلات الكروماتين الذي ربط النتائج في ترسب علامات النشطة (يوتشروماتين)، بما في ذلك ك acetylation H3/H4 و H3-K4 دي/ مثلايشن ثلاثي^5،6. بالإضافة إلى VP64، وقد تم المربوطة الوحيدات p65 المجمع NF-κB البشرية إلى الوحدة النمطية dCas9/جرنة⁷. من المثير للاهتمام، يؤدي الربط هذه المستجيبة لمناطق المنبع لمواقع بدء النسخ (تحديد) وداخلها المروجين تحريض جينات قوية. ومع ذلك، يمكن أيضا ممارسة المستجيبة VP64 و p65 آثار أكتيفاتوري حين ارتباطها بالمناطق الواقعة أسفل النهر لتحديد وفي معززات القاصي^7،8. للحصول على رد النسخي أكثر قوة، اندماج dCas9-VP64 أو dCas9-p65 متعددة بحاجة إلى تجنيد لهدف واحد موضع^9،10. على هذا النحو، أدت التطورات الأخيرة في تفعيل الجيل القادم، التي تقوم بتجنيد العديد من المجالات المستجيب بمجمع جرنة dCas9 واحد، مثل سونتاج، أقوى تنشيط القدرة مقارنة ب نظرائهم الانصهار dCas9-VP64^{11 , 12}-تم الحصول على تنشيط النسخي محسنة من خلال الدمج بين VP64، p65، و “هيئة الطرق والمواصلات” (VPR)، مجال transactivation من أشعة غاما-هيربيسفيروسيس، إلى ج-المحطة dCas9¹³ (الشكل 1A). وقد وضعت نظم كريسبر/dCas9 مماثلة للقمع محددة الهدف (الشكل 1B).

يمكن تحقيق القمع الجينات الذاتية مع اندماج قامع هندسيا من خلال مجموعة متنوعة من الآليات (الشكل 1B). وقد ثبت أن نظم كريسبر/dCas9، مرتبطة قامع دبد (حتى بدون مجال المستجيب/s)، يمكن إسكات كفاءة التعبير الجيني في حين المربوطة إلى مروج أو المنبع/المتلقين للمعلومات-خدمات الدعم التقني مناطق^{3،6 ،14}. آثار على النسخ بسبب تدخل الفراغية النسخ عامل ربط وتجهيز بوليميريز الحمض النووي الريبي. على الرغم من ذلك، يلزم اتباع نهج أكثر شمولاً، كما القمع الجينات بعائق الفراغية وحدها في كثير من الأحيان لا تكفي لإسكات صوت قوي. تطوير الجيل القادم من كواتم الصوت الأخيرة استناداً إلى نظم كريسبر/dCas9 تقل معدلات هيستون قامع النسخي المجالات (تردس)، (دي H3-K9-/مثلايشن ثلاثي، H3-K27 دي–/ثلاثي-مثلايشن؛ H3-K36 دي–/ثلاثي-مثلايشن، ديسيتيلاتيون H3/H4)، والحمض النووي (البد) مثلايشن أدت إلى بناء أدوات جينية السماح أكثر قوة إسكات آثار^4،5،،من^{1516، 17،18،،}من¹⁹²⁰. وقد ثبت أن توظيف هذه المعدلات جينية للحمض النووي قد يؤدي إلى تشكيل أكثر الكروماتين المغلقة والمكثفة، التي عادة ما تولد من أقوى إسكات نتائج^21،22. هو المجال الأكثر شيوعاً إسكات المستخدمة مع دبدس^4،مربع المرتبطة كربل (KRAB)⁵. وقد ثبت توظيف عامل لتتوافق مع التغييرات الكروماتين؛ ومع ذلك، آليات هذه التعديلات بعد أن أوضحت^16،،من¹⁷¹⁸. في الآونة الأخيرة، فقد ثبت أن إضفاء الطابع المحلي على KRAB للحمض النووي يمكن أن تعزز الجمعية methyltransferase هيستون SETDB1 والمجمعات نورد هيستون ديسيتيليشن (هداك)، مما يوحي بإمكانية أن هذه التفاعلات التوسط من أجل تشكيل التكثيف الكروماتين وإسكات النسخي^3،13. كنهج بديل، يمكن أن تنصهر فيها المجالات المستجيب دبدس لخلق بروتين إسكات جينية مخصصة. مباشرة يحفز هذا النظام القمعي علامات الحمض النووي أو تعديلات هيستون.

في الآونة الأخيرة، قد تم أغراض أخرى استخدام نظم كريسبر/dCas9 الاصطناعية المربوطة للانزيم DNMT3A للتعطيل النسخي. DNMT3A يحفز مثلايشن الحمض النووي التي تمارس القمع النسخي في جميع أرجاء تشكيل heterochromatin على مروجي الجينات الذاتية والأخرى^18،المناطق التنظيمية (الشكل 1B)²⁰. وكانت ماكدونالد et al.¹⁸ وفويتا et al.²⁰ الكتاب الأول التقرير أن مثلايشن الحمض النووي يمكن أن تستخدم لإسكات الجينات epigenome أو القمع، مما يدل على أن النظام الانصهار تسليم بلازميد dCas9-DNMT3A يمكن أن يعزز حقاً مثلايشن السيتوزين حول خدمات الدعم التقني من^18،20. ماكدونالد وزملاء العمل أظهرت أن توظيف الاستراتيجية قد يؤدي انخفاض كبير (حوالي 40%) في جين ورم القامع، مستويات مرناً CDKN2A ¹⁸. وبالمثل، يظهر استهداف منطقة المروج أونميثيلاتيد الجينات باخ أو IL6ST مثلايشن البد المتزايدة التي قد تم يرتبط بانخفاض مزدوج في التعبير الجيني²⁰. لدينا مختبر قد مؤخرا إعادة توجيه الغرض منه استخدام مثلايشن الحمض النووي لتخفيف النتائج المرضية من سنكا أوفيريكسبريشن (الشكل 2)²³. ترتكز الاستراتيجية على تعزيز انتقائية في مثلايشن الحمض النووي داخل منطقة إنترون 1 سنكا ، كما أفيد سابقا أن يكون هيبوميثيلاتيد في شعبة المشتريات والخرف مع ليفي الهيئات (دلب) العقول^{24،25، 26}. ارتبط هذا هيبوميثيليشن overexpression سنكا ، وهكذا تقدم هدفا جذاباً للتدخل العلاجي^24،،من²⁷²⁸. نحن مؤخرا قد أظهرت انخفاض مستوى الحمض النووي مثلايشن في إنترون سنكا 1 المنطقة في الشخصيات تتميز المستمدة من هيبسك التي تم الحصول عليها من مريض PD مع تريبليكيشن سنكا ²³. وميزة هذا النموذج التجريبي هو أن الشخصيات يمكن نشر قوة في الثقافة أو زيادة متباينة في الخلايا العصبية الناضجة، مما يتيح فحص كفاءة تحديد العوامل الوراثية التي تتوسط تعمل الخلوية، بما في ذلك عنصر مؤكسد الإجهاد والمبرمج²⁹. وعلاوة على ذلك، يتيح هذا النظام النموذجي العلماء تلخيص الأحداث التنموية التي حدثت قبل ظهور الأعراض في المرضى. وبالإضافة إلى ذلك، تمثل الشخصيات المستمدة من هيبسك أداة عظيمة لاختبار مسارات الخلوية والجزيئية المرتبطة بالتعبير الجيني. الأهم من ذلك، الشخصيات المستمدة من هيبسك جنبا إلى جنب مع الدولة من أحدث التكنولوجيا كريسبر/Cas9-ابيجينومي يمكن أن يسهل وضع “المخدرات الجيل القادم” للعديد من أمراض الأعصاب.

لتقليل مستويات مرضية للتعبير سنكا، وضعنا مؤخرا نظام قائم على لينتيفيروس تحمل البروتين الانصهار dCas9-DNMT3A، وجرنة بالتحديد الهدف البد مثلايشن داخل إنترون سنكا 1 (الشكل 2A)²³. وسيصف هذا البروتوكول متجه لينتيفيرال (LV) التصميم والإنتاج بالتفصيل. LVs تمثل وسيلة فعالة لتوصيل المكونات كريسبر/dCas9 لعدة أسباب، إلا وهي إدراج (ط) قدرتها على تحمل الحمض النووي الضخمة، (الثاني) كفاءة عالية لمجموعة واسعة نطاق من الخلايا، بما في ذلك الخلايا الفاصل سواء نونديفيدينج^{30 ترانسدوسينج} ، (ثالثا) وقدرتها على حمل ردود السامة للخلايا ومكسبه الحد الأدنى. في الآونة الأخيرة، ونحن تطبيق النظام LV تتميز هيبسك المستمدة من الخلايا العصبية من مريض مع تريبليكيشن محور سنكا وأظهر إمكانات LVs العلاجية لتقديم ابيجينومي–تحرير أدوات مثلايشن²³ ( الشكل 2B). في الواقع، يؤدي نظام LV-جرنة/dCas9-DNMT3A زيادة كبيرة في مثلايشن الحمض النووي في منطقة إنترون 1 سنكا . يقابل هذه الزيادة مع انخفاض مستويات سنكا مرناً والبروتين²³. وعلاوة على ذلك، تنقذ downregulation سنكا المتعلقة بالمشتريات تعمل في سنكا تريبليكيشن/هيبسك-مشتقة تتميز الخلايا العصبية (مثل المتقدرية روس إنتاج الخلية من الناحيتين)²³. الأهم من ذلك، أثبتنا أن التخفيض في التعبير سنكا بالنظام LV-جرنة-dCas9-DMNT3A قادر على عكس تعمل التي هي سمة مميزة للخلايا العصبية تتميز هيبسك المستمدة من مريض PD قاموا سنكا تريبليكيشن، مثل روس المتقدرية الإنتاج وخلية بقاء²³. والهدف من هذا البروتوكول هو 1) لتحديد البروتوكول للإنتاج وتركيز منصة LV الأمثل لتوليد الأعمال التحضيرية الفيروسية تيتيريد عالية و 2) لوصف التفريق بين هيبسكس إلى الشخصيات منقوشة لتصبح ناضجة تتميز ^31،الخلايا العصبية³² وتوصيف مستويات مثلايشن المنطقة المستهدفة داخل سنكا إنترون 1.

منصات لينتيفيرال لها ميزة كبيرة على منصة ناقلات الأكثر شعبية، إلا وهي المرتبطة بالغدد ناقلات (آفس)، الذي هو في السابق القدرة على استيعاب أكبر إدراج الوراثية^33،34. آفس يمكن أن تتولد في غلات أعلى بكثير ولكن تملك قدرة تغليف منخفضة (< 4.8 كيلو بايت)، المساس باستخدامها لإيصال نظم كريسبر/Cas9 الكل في واحد. وهكذا، يبدو أن LVs المنصة الاختيار في التطبيقات المشتركة في تقديم أدوات كريسبر/dCas9. ولذلك، سوف يكون البروتوكول الواردة هنا أداة قيمة للباحثين ورغبة منها في فعالية تسليم المكونات ابيجينومي–تحرير الخلايا والأجهزة. ويحدد البروتوكول كذلك الاستراتيجية الرامية إلى زيادة قدرات الإنتاج والتعبير لناقلات المرض عن طريق تعديل في رابطة الدول المستقلة من العناصر داخل ناقلات التعبير كاسيت^30،35. وتقوم الاستراتيجية على الرواية النظام المتقدمة ودراستها في المختبر لدينا ويسلط الضوء على قدرته على إنتاج الجزيئات الفيروسية في نطاق/mL الوحدات الفيروسية (فو)¹⁰ 10^30،35.