Piattaforma di vettore lentivirale per la consegna efficiente di strumenti di editing Epigenome nelle umane indotte da modelli di malattia derivati da cellule staminali pluripotenti

Più piattaforme di editing-epigenome sono stati recentemente sviluppati per indirizzare eventuali sequenze di DNA nelle regioni che controllano l’espressione genica^1,2. Gli strumenti di editing epigenome creati sono progettati per (i) regolare la trascrizione, (ii) modificare le modifiche post-traduzionali degli istoni, (iii) modificare la metilazione del DNA e (iv) modulano interazioni elemento regolatore. L’approccio di ancorare i modificatori di trascrizione/cromatina a un Cas9 (morto) disattivato (dCas9) generato da precedentemente sviluppati piattaforme epigenome di editing, come lo zinco dito proteine (ZFPs) e gli effettori di simil-attivatore di trascrizione (racconti), che harboring un dominio effector trascrizionale potente (ED) fuso a progettato dominio legante il DNA (DBD)³. I risultati del fenotipo desiderato come l’attivazione o la repressione è definito dalla molecola effettore ancorata ai loci endogene (Figura 1). Per creare attivatori trascrizionali programmabili, dCas9/gRNA moduli sono collegati a VP16^4,5,6 (Figura 1A), un dominio di attivazione virale che reclute Pol II ed il macchinario della trascrizione generale. La modifica di questo sistema ha incluso VP64, un tetramero di VP16 domini, fornendo un ancora più robusto attivazione tasso^5,6. Il sistema è stato impiegato con successo per attivare le regioni codificanti e non codificanti mirando ai promotori ed elementi regolatori. Cosa importante, anche se VP64 molecole non modificano direttamente la struttura della cromatina della regione di destinazione, recluta i modificatori di cromatina che legano i risultati nella deposizione dei marchi attivo (l’eucromatina), tra cui come H3/H4 acetilazione e H3-K4 di / Tri-metilazione^5,6. Oltre a VP64, la subunità p65 del complesso NF-κB umano ha stata legata alla dCas9/gRNA modulo⁷. È interessante notare che, il tethering di questi effettori per le regioni a Monte dei siti di inizio di trascrizione (TSSs) e all’interno di promotori si traduce in un’induzione genica forte. Tuttavia, VP64 e p65 effettori possono anche esercitare gli effetti attivatori pur essendo legata alle regioni situate a valle di TSSs e a distale rinforzatori^7,8. Per suscitare una risposta trascrizionale più robusta, più fusioni dCas9-VP64 o dCas9-p65 devono essere assunti per un bersaglio singolo locus^9,10. Come tale, il recente sviluppo di attivatori di prossima generazione, che reclutano domini effettrici multipli da un singolo dCas9-gRNA complesso, ad esempio SunTag, ha provocato una più forte capacità di attivazione confronto tra al dCas9-VP64 fusione controparti^{11 , 12}. un’attivazione trascrizionale migliore è stato ottenuto mediante la fusione di VP64, p65 e Rta (VPR), un dominio di transattivazione da gamma-herpesvirus, fino al C-terminale di dCas9¹³ (Figura 1A). Simili sistemi di CRISPR/dCas9 sono stati sviluppati per la repressione di target-specifici (Figura 1B).

Repressione del gene endogeno può essere raggiunto con fusioni derivati dal repressore attraverso una varietà di meccanismi (Figura 1B). È stato dimostrato che CRISPR/dCas9 sistemi, collegati al repressore DBD (anche senza un dominio effector/s), in modo efficiente possono tacere l’espressione genica mentre legato ad un promotore o a Monte/a valle-TSS regioni^{3,6 ,14}. Gli effetti sulla trascrizione è causato dall’interferenza sterica del legame del fattore di trascrizione ed elaborazione di RNA polimerasi. Tuttavia, sono necessari approcci più completi, come repressione genica di sterico da solo spesso non è sufficiente per il silenziamento robusto. Il recente sviluppo della prossima generazione di silenziatori basati su sistemi CRISPR/dCas9 che trasportano domini di repressore trascrizionale (TRDs), i modificatori dell’istone (H3-K9 di-/ tri-metilazione, H3-K27 di-/ tri-metilazione; H3-K36 di-/ tri-metilazione, H3/H4 deacetilazione) e portato alla costruzione di strumenti epigenetici che permette più robusto silenziamento effetti^{4,5,15,16, la metilazione del DNA (CpG) 17,18,19,20}. È stato dimostrato che l’assunzione di questi modificatori epigenetici al DNA può condurre alla formazione di più cromatina condensata e chiusa, che genera tipicamente un più potente silenziamento risultato^21,22. Il dominio più comunemente silenziamento utilizzato con DBDs è la casella associata Krüppel (KRAB)^4,5. L’assunzione del fattore è stata dimostrata per la corrispondenza con le modifiche della cromatina; Tuttavia, i meccanismi di queste modifiche sono ancora di essere chiarito^16,17,18. Recentemente, è stato dimostrato che la localizzazione di KRAB al DNA possa promuovere l’Assemblea dell’istone metiltransferasi SETDB1 e i complessi di NuRD istone deacetilazione (HDAC), suggerendo la possibilità che queste interazioni mediano la formazione di condensazione della cromatina e trascrizione silenziante^3,13. Come approccio alternativo, domini dell’effettore possono essere fusa a DBDs per creare una proteina di silenziamento epigenetica personalizzata. Questo sistema catalizza direttamente repressiva DNA marchi o modificazioni istoniche.

Recentemente, l’uso di sistemi CRISPR/dCas9 sintetici legato all’enzima di DNMT3A è stato reimpiegato per inattivazione trascrizionale. DNMT3a catalizza la metilazione del DNA che esercita la repressione trascrizionale durante la formazione dell’eterocromatina su promotori di geni endogeni e altre regioni regolarici (Figura 1B)^18,20. McDonald et al.¹⁸ e Vojta et al.²⁰ sono stati i primi autori a riferire che la metilazione del DNA può essere utilizzata per epigenome-genico o repressione, dimostrando che il sistema di fusione di plasmide-consegnato dCas9-DNMT3A potentemente può migliorare metilazione della citosina intorno il TSS^18,20. McDonald e colleghe hanno dimostrato che l’occupazione della strategia può provocare una riduzione significativa (circa il 40%) in un gene oncosoppressore, CDKN2A mRNA livelli¹⁸. Allo stesso modo, targeting della regione non metilato promotore dei geni BACH o IL6ST Mostra aumentata metilazione di CpG che è stata correlata con una riduzione di duplice nell’ espressione genica²⁰. Il nostro laboratorio ha recentemente riproposto l’uso di metilazione del DNA per l’attenuazione dei risultati patologici di SNCA sovraespressione (Figura 2)²³. La strategia si basa sul potenziamento selettivo nella metilazione del DNA all’interno della regione di introne 1 SNCA , come precedentemente è stato segnalato per essere ipometilato nel PD e demenza con Lewy (DLB) corpi cervelli^{24,25, 26}. Questo hypomethylation è stato collegato alla sovraespressione di SNCA , offrendo così un obiettivo attraente per intervento terapeutico^24,27,28. Recentemente abbiamo mostrato un basso livello di metilazione del DNA nel SNCA introne 1 regione in dopaminergici hiPSC-derivati NPC ottenute da un paziente del Palladio con la triplicazione di SNCA ²³. Il vantaggio di questo modello sperimentale è che gli NPC possono essere robustamente propagati nella cultura o ulteriormente differenziati nei neuroni maturi, che consente uno screening efficace identificare i fattori genetici che mediano fenotipi cellulari, tra cui ossidativo lo stress e l’apoptosi²⁹. Inoltre, questo sistema modello permette agli scienziati di ricapitolare gli eventi inerenti allo sviluppo che si sono verificati prima dell’insorgenza dei sintomi nei pazienti. Inoltre, hiPSC-derivati NPC rappresentano un ottimo strumento per testare le vie cellulari e molecolari connesse con l’espressione genica. D’importanza, hiPSC-derivati NPC abbinato alla tecnologia state-of-the-art CRISPR/Cas9-epigenome può facilitare notevolmente lo sviluppo di “farmaci di nuova generazione” per molte malattie neurodegenerative.

Per ridurre i livelli patologici di SNCA espressione, abbiamo recentemente sviluppato un sistema basato su lentivirus che trasportano una proteina di fusione dCas9-DNMT3A e gRNA specificamente metilazione di CpG di destinazione all’interno del SNCA introne 1 (Figura 2A)²³. Questo protocollo descriverà vettore lentivirale (LV) progettazione e produzione in dettaglio. LVs rappresentano un mezzo efficace di fornire componenti di CRISPR/dCas9 per diversi motivi, vale a dire (i) la loro capacità di trasportare ingombrante DNA inserti, (ii) un’alta efficienza di trasduzione un’ampia gamma di cellule, compreso le cellule di divisione sia nondividing³⁰ e (iii) loro capacità di indurre risposte citotossiche e immunogeniche minimale. Recentemente, abbiamo applicato il sistema di LV a neuroni dopaminergici hiPSC-derivato da un paziente con la triplicazione del locus SNCA e dimostrato il potenziale terapeutico di LVs per la consegna di editing epigenome metilazione²³ ( degli strumenti Figura 2B). Infatti, un sistema di LV-gRNA/dCas9-DNMT3A provoca un significativo aumento nella metilazione del DNA alla regione dell’introne 1 SNCA . Questo aumento corrisponde con la riduzione dei livelli di mRNA e proteina SNCA ²³. Inoltre, SNCA downregulation Salva fenotipi PD-relative nel SNCA triplicazione/hiPSC-derivato dopaminergico neuroni (ad esempio, mitocondriale ROS produzione e cella vitalità)²³. Cosa importante, abbiamo dimostrato che la riduzione dell’espressione di SNCA dal sistema LV-gRNA-dCas9-DMNT3A è in grado di invertire i fenotipi che sono caratteristici per i neuroni dopaminergici hiPSC-derivato da un paziente di PD che ha trasportato il SNCA triplicazione, quali mitocondriale ROS produzione e cellula attuabilitಳ. L’obiettivo del presente protocollo è 1) per delineare il protocollo di produzione e la concentrazione di una piattaforma ottimizzata di LV per la generazione di alta-risero preparati virali e 2) per descrivere la differenziazione di hiPSCs in NPC modellato per diventare maturo dopaminergici neuroni^31,32 e la caratterizzazione dei livelli di metilazione della regione mirata all’interno di SNCA introne 1.

Lentivirali piattaforme hanno un vantaggio importante sopra la piattaforma più popolare di vettore, vale a dire adeno-associato vettori (AAVs), che è capacità l’ex di ospitare grandi inserti genetici^33,34. Adenoassociati possono essere generate in rendimenti significativamente più elevati ma possiedono una capacità di confezionamento basso (< 4,8 kb), compromettendo il loro uso per la distribuzione di sistemi CRISPR/Cas9 all-in-one. Così, sembra che il LVs sarebbe la piattaforma di scelta nelle applicazioni coinvolte nella fornitura di strumenti CRISPR/dCas9. Pertanto, il protocollo descritto qui sarà uno strumento prezioso per i ricercatori desiderosi di fornire in modo efficace modifica epigenome componenti di cellule e organi. Il protocollo ulteriormente delinea la strategia per aumentare le capacità di produzione ed espressione dei vettori tramite una modifica in cis degli elementi all'interno del vettore espressione cassetta^30,35. La strategia si basa sul romanzo sistema sviluppato e studiato nel nostro laboratorio ed evidenzia la sua capacità di produrre particelle virali nella gamma di 10¹⁰ unità virali (VU) / ml^30,35.