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Immunology and Infection

Un alto rendimiento Shigella-ensayo bactericida específico

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59164
, , ,
1Department of Enteric Infections, Bacterial Diseases Branch,Walter Reed Army Institute of Research, 2University of Alabama at Birmingham

Summary

Aquí presentamos un protocolo para medir actividad de Shigellacidal de anticuerpos en suero. Suero se mezcla con las bacterias y complemento exógeno, que se incubó, y la mezcla de reacción se platea en placas de agar. Viables bacterias forman colonias que se cuentan, usando un enumerador de colonias automatizado y permite determinar la concentración bactericida.

Abstract

Análisis bactericidos del suero (SBAs) miden la actividad funcional de los anticuerpos y se han utilizado por muchas décadas. SBAs miden directamente la actividad de matanza de anticuerpos mediante la evaluación de la capacidad de los anticuerpos en el suero se unen a bacterias y activar el complemento. Esta activación del complemento produce la lisis y muerte de las bacterias de la blanco. Estos ensayos son valiosos porque van más allá de la cuantificación de la producción de anticuerpos para aclarar las funciones biológicas que tienen estos anticuerpos, permitiendo a los investigadores estudiar el papel que pueden desempeñar los anticuerpos en la prevención de la infección. SBAs se han utilizado para estudiar las respuestas inmunitarias para muchos patógenos humanos, pero actualmente no hay ninguna metodología ampliamente aceptada para Shigella . Históricamente, SBAs han sido muy intensivas, que requiere muchas etapas que demandan tiempo para cuantificar con precisión las bacterias sobrevivientes. Este protocolo describe un simple, robusto y alto rendimiento del análisis las medidas funcionales anticuerpos específicos Shigella en suero in vitro. El método aquí descrito ofrece muchas ventajas sobre el tradicionales SBAs, incluyendo el uso de las poblaciones bacterianas congelados, 96 ensayo bien placas, sistema de micro-cultivo y recuento automatizado de Colonia. Todas estas modificaciones hacen este análisis menos trabajosa y más alto rendimiento. Este protocolo es más simple y rápida de realizar que la tradicionales SBAs y seguir utilizando tecnologías simples y reactivos fácilmente disponibles. El protocolo se ha aplicado con éxito en varios laboratorios independientes y la prueba es robusta y reproducible. El ensayo puede utilizarse para evaluar la respuesta inmune en estudios preclínicos como clínicos. Cuantificación de shigellacidal los títulos de anticuerpos antes y después de la exposición del antígeno (ya sea por vacunación o infección) permite una comprensión más amplia de cómo funcional los anticuerpos se generan respuestas y su contribución a la inmunidad protectora. El desarrollo de este estandarizado, ensayo bien caracterizado puede facilitar mucho diseño de vacuna contra la Shigella .

Introduction

Serotipos de Shigella , Shigella flexneri 2a, 3a de S. flexneri y S. sonnei, demuestran prevalencia epidemiológica a nivel mundial. La enfermedad diarreica causada por estos Shigella especie impactos militares, los viajeros1y es la principal causa de muerte diarreica entre los niños menores de 5 en los países en desarrollo2. Actualmente no hay vacunas con licencia para proteger contra Shigella, sin embargo, hay varias candidatas a vacunas en diferentes etapas del desarrollo. Muchas de estas vacunas y otras medidas profilácticas actualmente en desarrollo, se centran en anticuerpos producidos contra Shigella lipopolysaccharide (LPS). LPS es un candidato de vacuna atractiva porque es un importante antígeno de superficie y la infección natural con Shigella induce anticuerpos específicos para LPS que pueden ser protectoras contra la reinfección de una manera específica de serotipo. Por lo tanto, una vacuna exitosa de Shigella probablemente tendrá que ser multi-valent y blanco 3-4 que serotipos de Shigella para inducir inmunidad contra el 70-80% de todo el mundo circulan cepas3,4, 5 , 6. esto requiere ensayos para evaluar a los candidatos de vacuna contra la Shigella específicos para varios serotipos diferentes.

Ensayos inmunológicos actuales para evaluar las vacunas candidatas son centran en cuantificar los niveles de los títulos de anticuerpos, pero existen pocos ensayos bien caracterizados para evaluar anticuerpos funcionales. El examen de la capacidad funcional de anticuerpos es importante porque los anticuerpos específicos de patógeno están responsables de la lucha contra la infección a través de una serie de mecanismos funcionales incluyendo atar antígenos de superficie de las bacterias y prevenir la adherencia a y infección de células epiteliales, dirigidos a las células bacterianas o la opsonización y la fagocitosis y directamente matando patógenos por vinculante e iniciando la cascada del complemento. La muerte directa de las bacterias por anticuerpos se produce cuando los anticuerpos se unen a los componentes superficiales de las bacterias de la blanco e inician la cascada del complemento lleva a la activación de zimógenos muchos que en última instancia resulta en la formación de poros en las bacterias la célula causa la muerte de lisis y bacteriana. Este asesinato directo de las bacterias por anticuerpos y complemento de la circulación puede ser una crucial primera línea de defensa durante la infección.

Los individuos naturalmente infectadas tienen anticuerpos con actividad de shigellacidal en sus sueros. Estos anticuerpos específicos de Shigellafueron detectados utilizando la tradicional matanza de complemento-mediada ensayos 7,8. Esto indica que puede ser un papel de anticuerpos bactericidos en la protección contra la Shigella. Ensayos bactericidos tradicionales son sencillos en su ejecución: el suero es inactivado con calor (para destruir la actividad del complemento endógeno) y mezclado con las bacterias de interés. Complemento exógeno se añade a esta mezcla en una concentración específica. La mezcla de reacción se incuba para permitir la matanza bacteriana y luego plateada para confirmar unidades formadoras de colonias (UFC). Una vez que UFC se cuenta, se puede calcular un índice de homicidio de 50% (KI) y un título de SBA determina. Si bien este procedimiento es relativamente sencillo, estos ensayos pueden ser intensivas y desperdiciador de tiempo para llevar a cabo y los resultados pueden ser muy variables. Además de estas limitaciones, no bien caracterizados análisis funcionales existen para Shigella. Por lo tanto, con éxito hemos desarrollado y calificado un análisis simple, de alto rendimiento para medir la actividad bactericida de Shigella para tres de las cepas clínicamente más relevantes9. Este protocolo describe una SBA con modificaciones que mejoran la eficiencia de ensayo y reproducibilidad. La primera de estas modificaciones es el uso de las poblaciones bacterianas congelados. La producción de las existencias solo uso elimina la necesidad para cultivar bacterias frescas para cada ensayo reduciendo también la variabilidad del ensayo a ensayo. Otro tiempo y trabajo ahorro ventaja de este protocolo es el uso de un formato de ensayo de placa de 96 pocillos. Esto permite una dilución seriada de muestras que puede probar una gama de concentraciones.  También permite el uso de pipetas multicanales para platear las muestras en platos de Petri cuadrada. Cuando se utilizan estos cuadrados de Petri junto con un sistema de cultivo que produce colonias de micro, se reduce el número de placas de agar para el ensayo. Esto, en combinación con software de conteo de Colonia libremente disponible, desarrollado originalmente para el neumococo opsonofagocítico multiplexado matando a10de ensayo (MOPA), permite la enumeración de colonias automatizada, rápida y confiable. Todas estas mejoras de reducen significativamente el tiempo de práctica de análisis y creación de un sistema de alto rendimiento que permite múltiples placas para ejecutarse a la vez.

Aunque este protocolo ha sido optimizado para tres de los serotipos más clínicamente relevantes de la Shigella, la SBA aquí descrita puede aplicarse fácilmente a muchas otras bacterias patógenas. Además del uso potencial de este protocolo con otras bacterias, este protocolo tiene el potencial de expandirse más allá de usar solo suero como material de partida, que podría incluir el análisis de anticuerpos en otros tipos de muestras relevantes como muestras de mucosa, como saliva y muestras de heces. El uso de este ensayo para investigar la respuesta inmunológica después de la vacunación puede dar mayor penetración en la respuesta inmune generada por la vacunación conduce al diseño racional de vacunas, y ayuda en la comprensión de la inmunidad natural cómo se desarrolla.

Protocol

Este protocolo sigue las directrices de la Junta de protección del sujeto humano WRAIR. Las muestras utilizadas en este estudio son las muestras de suero humano recogidas como parte del WRAIR protocolo número 1328, cumple con todos los reglamentos institucionales y federales que rigen la protección de sujetos humanos. Las muestras fueron anónima, y el uso de estas muestras anónimas fue clasificado como investigación de sujeto no humano por la IRB UAB (número de protocolo N150115001). 1. preparar los reactivos de ensayo Preparar 1% gelatina agregando 1 g de gelatina en 100 mL de agua. Autoclave y almacenar a temperatura ambiente. Prepare solución TTC (2,3,5-Trifeniltetrazolio cloruro) con 100 mg/mL (1, 000 x) mediante la adición de 5 g de TTC a 40 mL de agua. Cuando se haya disuelto completamente el TTC, ajustar el volumen a 50 mL con agua y filtro estéril con filtro de 0.2 μm. La solución a 4 ° C y proteger de la luz.Nota: TTC colorea las colonias bacterianas y los hace mucho más fácil de contar. Solución TTC tiene un leve color amarillo. Si solución TTC desarrolla un color rojo, descartar y preparar fresco. Prepare 10% sodio azida (NaN3) solución (100 x) mediante la adición de 5 g de NaN3 a 40 mL de agua. Después de la completa disolución, añadir agua a 50 mL. Almacenar a temperatura ambiente.PRECAUCIÓN: Azida de sodio es un veneno y puede ser tóxica si se ingiere o absorbe a través de la piel o los ojos. Puede reaccionar con plomo y tuberías de cobre para formar azidas metálicas altamente explosivas. Para desechar reactivos que contienen azida de sodio, lavar con un gran volumen de agua para evitar la acumulación de azida o deséchelo en una bolsa de biohazard. Preparar agar LB (placa) de LBA mediante la adición de 35 g de agar LB a 1 L de agua y autoclave. Añadir 25 mL en cada placa Petri cuadrada (120 x 120 mm2). Incube las placas a temperatura ambiente durante 10-20 minutos para permitir que el agar solidifique. Coloque las placas en bolsas de plástico y almacenar a 4 ° C durante 1 mes. Preparar Agar de recubrimiento mediante la adición de 7,5 g de agar a 1.000 mL de agua y autoclave. Incubar en baño de agua de 56 ° C hasta que se necesite. Justo antes del uso, añadir 1 mL de 100 mg/TTC y 10 mL de 10% NaN3 y mezclar bien.Nota: Cada placa LBA necesita 25 mL de Agar de recubrimiento. Agar de recubrimiento puede ser dispuesta hasta a un mes de anticipación y derretido en el microondas o en una placa caliente según sea necesario para el ensayo. Asegurarse de que la temperatura del agar es ~ 55 ° C antes de aplicar a las placas LBA. Preparar el tampón de ensayo agregando 5 mL de 10 x Hanks equilibrada sal solución (HBSS) con Ca2 +/Mg2 + y 5 mL de gelatina 1% a 40 mL de agua. Almacenar a temperatura ambiente. 2. prepare el complemento y las bacterias Preparar conejo bebé complemento (BRC)Nota: Detallada de criterios para selección de lote de complemento se puede encontrar aquí: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf Obtener BRC congelado y descongelar con agua fría. Mezclar físicamente la BRC cada ~ 10-20 min hasta que completamente descongelada. No exponga la BRC a congelar repetidos ciclos de descongelación. Mientras que BRC está descongelando, etiquetar tubos de centrífuga de 1.5 mL, 5mL o 15 mL. Lugar con la etiqueta los tubos en hielo para pre-enfriar. Volumen alícuota apropiada BRC en los tubos de centrífuga previamente enfriado (después del llenado, devuelva inmediatamente cada tubo en el hielo). Guardar alícuotas a ≤-70 ° C en el congelador.Nota: Aproximadamente de 1 m del complemento es necesario para cada placa de ensayo. Alícuotas de complemento son de un solo uso y deben ser alícuotas en volúmenes correspondientes a diseños de ensayo. Para preparar BRC inactivado con calor, descongele una alícuota del activo BRC. Preparar un baño de agua de 56 ° C. Después de BRC está completamente descongelada, transferencia a la bañera de agua e Incube por 30 minutos. Después de la incubación, retirar BRC inactivadas por calor del baño María y deje que se enfríe a temperatura ambiente durante 10-15 minutos mezcla vigorosamente y alícuota ~ 150 μL en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Guardar alícuotas a ≤-10 ° C. Preparar blanco de acción de las bacteriasNota: El siguiente procedimiento se utiliza para preparar 48 alícuotas de acción de las bacterias objetivo; Si se necesitan más alícuotas el protocolo puede ampliarse. Quitar la bacteria principal del frasco del congelador y raspe la superficie bacteriana congelada para extraer una pequeña cantidad de hielo desde el vial sobre una placa de agar sangre. Devuelva inmediatamente el maestro frasco de stock en el congelador. Esta pequeña alícuota de acción bacteriana sobre la placa de agar sangre y cúbralo con la tapa de la placa de la raya. Incubar la placa boca abajo durante una noche en 37 °C/5% CO2 incubadora. Transferencia de ~ 10 colonias lisas aisladas a un tubo de 50 mL que contenga 30 mL de caldo LB. Incubar durante 3-5 h a 37 ° C con agitación suave hasta que el caldo de cultivo tiene un OD600 ~0.6-0,7. Cosecha de la parte superior 12,5 mL de la cultura y la transferencia a un nuevo tubo 50 mL. Centrifugar el cultivo a 15.000 x g durante 2 min con una microcentrífuga de mesa. Deseche el sobrenadante y Resuspenda el sedimento en 25 mL de glicerol estéril de 15%-LB. Mezclar bien y distribuir alícuotas de 0,5 mL en tubos de centrífuga micro estériles de 1.5 mL (~ 48 tubos). Guardar alícuotas a ≤-70 ° C en el congelador. Confirmar la identidad bacteriana utilizando la prueba de aglutinación antes de su uso. Determinación del factor de dilución óptima para la acción de las bacterias objetivoNota: Cada lote de la acción de las bacterias objetivo debe titularse en condiciones de ensayo para determinar la dilución necesaria para producir 120 ~ UFC/lugar en placas de LB. Haz una placa de microtitulación (placa de dilución) y agregar 135 μl de tampón de ensayo a 1A. Añadir 120 μl de mantequilla ensayo pozos 1B – 1H. Retire un frasco de bacterias blanco congelado del congelador y descongelar a temperatura ambiente. Añadir 15ul de acción bacteriana descongelada a 1A para hacer una dilución de 10 veces de la acción bacteriana. Transferir 30 μl de la solución bacteriana de bien 1A a la 1B bien para llevar a cabo una dilución seriada 5-fold. Continuar 5-fold diluciones seriadas para así H 1 de un total de 8 diluciones (1:10 1:50; 1: 250, 1:1 250; 1:6 250, 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250). Conseguir otra placa de microtitulación (placa de ensayo) y añadir 20 μl de tampón de ensayo todo bien en las columnas 1 y 2 en la placa de ensayo. Transferir 10 μl de bacterias diluidas de cada bien en la columna 1 de la placa de la dilución en los pocillos correspondientes en las columnas 1 y 2 de la placa de ensayo. 10 μl de las bacterias es transferido de 1A bien de la placa de la dilución en bien 1A y 2A en el ensayo de placa, etcetera. Continuar con el ensayo descrito en ensayo bactericida del suero (SBA) a continuación para Control A y B de Control, pasos 3.6-3.12. Después de que las placas han sido incubadas en hielo, utilice una pipeta multicanal con 8 puntas de pipeta a 10 μl de los pozos en la columna 1 en una placa LBA. También, ver los pocillos de la columna 2 en la placa LBA. Continuar con el ensayo como se describe abajo en pasos 3.14-4.6. Determinar la dilución de las bacterias que produce ~ 120 que UFC/punto de Control B, esta dilución se utilizará en el ensayo. 3. suero ensayo bactericida (SBA) Nota: El procedimiento descrito a continuación es para una placa de ensayo, pero puede aumentarse el número de las placas de ensayo. Inactive por calor muestras por incubación de las muestras de ensayo en un baño de agua de 56 ° C durante 30 minutos.Nota: Las muestras de prueba deben ser inactivadas por calor antes de la prueba a derogar cualquier actividad del complemento endógeno. Esto puede hacerse por delante de lo análisis y muestras inactivadas pueden volver a congelarse o almacenadas a 4 ° C hasta probado. Haz una placa de ensayo y añadir 20 μl de tampón de ensayo a las columnas 1 a 12 de filas A través del G. Añada 20 μl de tampón de ensayo a las columnas 1 y 2 de la fila H, vea la tabla 1. 30 μl de cada muestra, por duplicado, a la columna H de la placa de ensayo de carga. Por ejemplo, dispensar 30 μl de la muestra 1 en pozos de 3 H y 4 H y 30 μl de la muestra 2 la dosificación en pozos de 5 H y 6 H, etcetera. Realizar diluciones seriadas 3-fold de prueba de las muestras con una pipeta multicanal. Retirar 10 μ de la muestra de pozos 3H – 12H y la transferencia a los pocillos correspondientes en la fila G y mezclar la muestra bien mediante pipeteo arriba y abajo 8 – 10 veces. Quite 10 μ de pozos 3G – 12G y transferir a los pocillos correspondientes en la fila F y mezclar bien. Continuar con estas diluciones seriadas a través de fila A. Después de mezclar los pozos en la columna A, quitar y desechar 10 μl de pozos 3A-12A para que todos los pozos contienen 20 μl.Nota: Ya en un volumen de ensayo total de 80 μl 20 μl de suero, hay una dilución adicional 4 veces en el ensayo. Esta dilución debe tenerse en cuenta durante el cálculo de un título de SBA multiplicando la dilución de suero por 4. Por ejemplo, si se utiliza una dilución inicial de 1:2, la dilución real está probada es 1:8. Retire un frasco de Stock de bacterias blanco congelado y descongelar a temperatura ambiente. Diluir las bacterias en 20 mL de tampón de ensayo según el factor de dilución óptima determinado (factor de dilución se determinó en la sección 2.3). Añadir 10 μl de bacterias diluidas en cada pocillo de la placa de ensayo usando una pipeta multicanal. Retire un frasco de BRC congelado y un vial de congelado inactivado con calor BRC, descongelar a temperatura ambiente con agua fría o colocar sobre la rejilla de seguridad biológica con aire para descongelar rápidamente. Preparar una solución 20% de BRC inactivadas por calor. Mezclar 100 μl de BRC inactivadas por calor con 400 μL de tampón de ensayo. Añadir 50 μl de esta solución BRC inactivadas por calor de 20% a todos los pozos en la columna 1 (Control A pozos).Nota: BRC inactivadas por calor se utiliza como control para monitorear muerte inespecífica (NSK) en el ensayo. Preparar una solución 20% de nativo BRC. Mezclar 1 mL de BRC nativa con 4 mL de tampón de ensayo. Añadir 50 μl de esta mezcla a todos los pozos en las columnas 2 a la 12 (pozos Control B y prueba de la muestra).Nota: La concentración final de BRC en la mezcla de reacción es de 12.5%. Brevemente mezcla ensayo placa agitando suavemente durante 10-15 s en un agitador de placa o mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 8 veces con una pipeta multicanal. Poner la placa de ensayo en incubadora microbiológica de 37 ° C por 2 h (sin agitar). Seco 2 placas LBA quitando las tapas y colocar las placas de frente en gabinete para 40-60 min de seguridad biológica. Cuando haya finalizado la incubación de 2 h, mueva la placa de ensayo húmedo hielo e incubar durante 10-20 minutos detener la reacción. Con una pipeta 12 canales, mezcla los pocillos en la fila H y punto placa 10 μl de la mezcla de reacción en la parte inferior de una placa LBA. Inmediatamente incline la placa y deje que los lugares para ejecutar para ~1.5-2 cm. Repita este procedimiento para fila G, F y E manchado por encima de la fila anterior en la placa de LBA. Fila E, F, G y H son vistos en una placa de LBA y fila A, B, C y D son vistos en un segundo plato LBA de la misma manera, vea la figura 1. Incubar las placas LBA a temperatura ambiente hasta que la solución se adsorbe en las placas LBA (10-15 min). Ponga las tapas en las placas LBA y coloque las placas LBA en la incubadora microbiológica al revés para incubar durante una noche (~ 16-18 h). Incubar S. flexneri 2a y 3a a 29 ° C e incubar S. sonnei es a 26 ° C.Nota: Estas temperaturas producen colonias más pequeñas”micro-” con tamaños adecuados para la cuenta exacta por un contador de Colonia9. Después de la incubación durante la noche, agregar 25 mL de Agar de recubrimiento (a ~ 55 ° C) que contiene 100 μg/mL TTC y 0.1% NaN3 a cada placa LBA. Incubar las placas LBA a 37 ° C por 2 h para permitir que las bacterias sobrevivientes a desarrollar color rojo, ver figura 1 a continuación. Usando una cámara digital de fotografía y transferir imágenes a un ordenador donde se ha instalado Software enumerando Colonia integrada de NIST (Niza), véase la figura 2.Nota: BUEN recuento de Colonia está disponible sin cargo. Ver Lista de materiales para detalles e instrucciones de instalación. 4. recuento bacteriano colonias Software abierto agradable entrada Nombre del operador, información del experimento y cualquier análisis notas en los campos vacíos. Una vez introducido este datos haga clic en el botón hecho . Fotografiados placas de importación haciendo clic en el botón abrir y seleccionar los archivos correctos en el equipo. Ajustar los parámetros de ensayo estableciendo el número de filas a 4 y el número de columnas a 12. Ajustar la configuración de fondo a-3 sigma y la resolución de baja. Vea la figura 2. Mueva las regiones de interés (ROIs) haciendo clic y arrastrando para que cada ROI es directamente sobre el lugar de una muestra. Asegurar que todas las colonias bacterianas dentro del ROI con ningún traslapo entre las muestras. Una vez que una placa es completa, haga doble clic en la placa siguiente en la lista de imágenes de datos almacenados y ajuste el ROIs. Vea la figura 2. Cuando se han ajustado todas las placas, haga clic en el botón verde de la cuenta , ver figura 2 y figura 3. Terminada la cuenta, haga clic en el botón exportar para exportar los datos en formato.xls/.xlsx. Nombre y guarde el archivo.xls/.xlsx para análisis de datos. Organizar exportado los datos en un formato de tabla para que las cuentas se organizan en una tabla que representa la placa de 96 pocillos de ensayo, ver tabla 2. 5. calcular el título de SBA (KI) y matanza no específicos (NSK) Nota: Título de la SBA o índice de matanza (KI) se define como el recíproco de la dilución de suero que mata al 50% de las bacterias de la blanco. Calcular el 50% a valor de corte del índice (KI) con un promedio de la UFC de pocillos de control activa complemento (Control de B) y dividiendo por 2. Calcular la UFC promedio para cada dilución de cada muestra que se ejecutó por duplicado, consulte la tabla 3. Debido a una dilución de suero raramente producirá exactamente este valor KI de 50%, puede ser interpolada de dos diluciones de suero secuencial, uno que mata a menos del 50% y que mata a más del 50%, ver figura 4. A continuación se muestra la fórmula para calcular la KI interpolados de la SBA:Nota: El título bactericida, o KI, también se puede calcular de forma automática mediante software Opsotiter desarrollado por UAB. Para solicitar Opsotiter, póngase en contacto con el Dr. Moon Nahm o Sr. Rob Burton. Ver https://www.vaccine.uab.edu para información de contacto. Calcular el valor NSK tomando 1 menos el promedio de Control de B dividido por el promedio de Control de A.

Representative Results

Un diseño de placa de 96 pocillos en un ensayo típico se muestra en la tabla 1. Este diseño tiene los pocillos de control activa complemento (Control de B), los pozos de control de complemento inactivadas por calor (controlar) y cinco muestras por duplicado. Las muestras se diluyen en serie 3-fold hasta la placa de fila a fila una permitiendo 8 diluciones de cada muestra a probar a la vez. La figura 1 muestra dos placas LBA después de la adición de incubación y recubrimiento durante la noche. Desarrollo del color ha llevado a cabo y todas las colonias sobrevivientes son visibles en rojo. Muerte bacteriana se ve claramente por todas las muestras probadas en las tres primeras diluciones (filas F-H) y como se diluyen las muestras más arriba la placa, se observa una disminución en la matanza bacteriana donde el suero es menos concentrado. AGRADABLE interfaz puede verse en la figura 2. Cuentas micro-Colonia desde el software bonito pueden verse en la figura 3, y estas cuentas han sido organizadas en la tabla 2. Se calcula el recuento promedio de UFC para cada dilución de cada muestra y se calcula un valor KI de 50% en la tabla 3. Este valor KI de 50% puede aplicarse a la UFC promedio para cada dilución de suero para determinar los valores necesarios para calcular la KI SBA según la fórmula descrita en la figura 4. El resultado final del ensayo se muestra en la tabla 4. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Control A Control B Dilución 8 Dilución 8 Dilución 8 Dilución 8 Dilución 8 Dilución 8 Dilución 8 Dilución 8 Dilución 8 Dilución 8 B Control A Control B Dilución 7 Dilución 7 Dilución 7 Dilución 7 Dilución 7 Dilución 7 Dilución 7 Dilución 7 Dilución 7 Dilución 7 C Control A Control B Dilución 6 Dilución 6 Dilución 6 Dilución 6 Dilución 6 Dilución 6 Dilución 6 Dilución 6 Dilución 6 Dilución 6 D Control A Control B Dilución 5 Dilución 5 Dilución 5 Dilución 5 Dilución 5 Dilución 5 Dilución 5 Dilución 5 Dilución 5 Dilución 5 E Control A Control B Dilución 4 Dilución 4 Dilución 4 Dilución 4 Dilución 4 Dilución 4 Dilución 4 Dilución 4 Dilución 4 Dilución 4 F Control A Control B Dilución 3 Dilución 3 Dilución 3 Dilución 3 Dilución 3 Dilución 3 Dilución 3 Dilución 3 Dilución 3 Dilución 3 G Control A Control B Dilución 2 Dilución 2 Dilución 2 Dilución 2 Dilución 2 Dilución 2 Dilución 2 Dilución 2 Dilución 2 Dilución 2 H Control A Control B Dilución 1 Dilución 1 Dilución 1 Dilución 1 Dilución 1 Dilución 1 Dilución 1 Dilución 1 Dilución 1 Dilución 1 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Tabla 1: diseño de placa de ensayo. Las columnas 1 y 2 contienen los pocillos de control del complemento. Control A se encuentra en la columna 1 y es inactivada por el calor complementan el control, que contiene el tampón de SBA, bacterias y complemento inactivadas por calor. Control B se encuentra en la columna 2 y es el complemento de control, que contiene el tampón de SBA, bacterias y complemento. Columnas 3-12 contienen las muestras de suero. Cada muestra se ejecuta duplicado y diluidas en serie 3-fold de fila H para columna A Figura 1: las placas LBA después del desarrollo de color. Representante S. flexneri 3a micro colonias bacterianas han crecido durante la noche hasta el tamaño adecuado. Se ha añadido agar de recubrimiento y colonias han desarrollado un color rojo por la reducción de TTC compuesto en el agar de recubrimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: interfaz de software de NIST enumerador de Colonia integrada (Niza). Representación gráfica de la interfaz agradable. Las regiones de interés (ROIs) estén centradas sobre las colonias para cada punto antes de contar. Los datos pueden ser exportados directamente desde la ventana agradable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: LBA placas Software bien contado en. Se cargan las imágenes de fotografía color en agradable software y unidades formadoras de colonias (UFC) se contabilizan automáticamente. Esta imagen muestra dos placas LBA representante con su información de cuenta colonias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 185 167 145 35S 122 134 119 142 124 115 113 123 1:17496 Dilución 8 186 152 145 138 132 135 108 116 100 119 105 109 1:5832 Dilución 7 179 160 145 135 109 120 54 55 71 75 79 89 1:1944 Dilución 6 193 153 146 138 87 105 5 6 6 9 19 30 1:648 Dilución 5 184 129 32s 143 6 7 0 1 1 1 1 1 1:216 Dilución 4 180 145 22 24 2 3 3 1 1 0 0 0 1: 72 Dilución 3 207 129 1 0 2 2 1 0 4 1 0 1 1:24 Dilución 2 201 140 0 0 0 0 1 1 1 0 4 4 1:8 Dilución 1 Control A Control B Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Tabla 2: conteo de colonias bacterianas. Recuentos de UFC se exportan desde el buen software en formato excel. Estas cuentas se pueden organizar en una tabla que muestra que el bacteriano cuenta para todas las muestras duplicadas y pocillos de control. Control A Control B 148 128 131 120 118 1:17496 Dilución 8 189 147 142 134 112 110 107 1:5832 Dilución 7 NSK (1-CtrB/CtrA): 22% 140 115 55 73 84 1:1944 Dilución 6 50% KI (CtrB/2): 73 142 96 6 8 25 1:648 Dilución 5 132 7 1 1 1 1:216 Dilución 4 23 3 2 1 0 1: 72 Dilución 3 1 2 1 3 1 1:24 Dilución 2 0 0 1 1 4 1:8 Dilución 1 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Tabla 3: cálculo del valor de corte de KI de 50% y los promedios de la muestra duplicada. El valor de corte de KI de 50% se calculó tomando el promedio de todos los pozos de Control B y dividiendo por 2. Se calcularon los promedios de duplicados para cada dilución de cada muestra que se ejecutó por duplicado. También se calcula el valor NSK. Figura 4: esquema de interpolación lineal. El número de bacterias supervivientes (eje y) a cada dilución de suero que es probado (eje x) traza (diamante negro), y los puntos individuales están conectados por la línea negra delgada, discontinua. Las líneas sólidas y discontinuas horizontales indican 0% y 50% muerte, respectivamente. Las diluciones de suero encima (dilución 5) y abajo (dilución 4) el 50% línea de matar son conectado por una línea roja, y se indica título bactericida (KI). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. SBA KI Muestra 1 72 Muestra 2 216 Muestra 3 1994 Muestra 4 1994 Muestra 5 648 Tabla 4: SBA resultados mostrando título bactericida (KI). Valores de KI de SBA finales han sido determinados para cada muestra y se muestran. Estos valores se calculan utilizando el promedio UFC, el valor de corte de KI de 50% y la fórmula de interpolación lineal.

Discussion

El protocolo descrito aquí muestra un análisis funcional inmune para evaluar la actividad de shigellacidal de anticuerpos en suero. En el ensayo demostrado para este protocolo monoclonal anticuerpos específicos para S. flexneri 3a eran usados9 junto con suero humano control de una anterior vacuna Shigella estudio11. La fuente de suero probado en este ensayo puede variar ampliamente de muestras animales preclínicas a muestras clínicas humanas, y la actividad shigellacidal de la muestra de suero se verá afectada por las vacunas y las exposiciones que ha experimentado el individuo. Puede esperarse alguna reactividad cruzada entre serotipos estrechamente relacionados, específicamente 2a S. flexneri y S. flexneri 3a pero poca reactividad cruzada se ha visto en estas cepas en comparación con la S. sonnei9. La base de la SBA se centra en la activación de la cascada del complemento por la Unión antígeno-anticuerpo. Por lo tanto, la manipulación del reactivo BRC es uno de los muchos pasos críticos involucrados en la ejecución del presente Protocolo. BRC fue seleccionado para su uso en este ensayo debido a su consistente desempeño y bajos niveles de NSK en otros ensayos bactericida12,13,14.  La actividad de BRC es termosensible y deberán tomarse las medidas apropiadas para asegurar que congelar descongelar los ciclos se reducen al mínimo, que la BRC es alícuotas en volúmenes de uso individual, y que las alícuotas de la BRC son descongeladas rápidamente, inmediatamente antes de su uso en el ensayo. La consistencia de la actividad del complemento impactará la reproducibilidad de este ensayo. Otro paso crítico que afectan la reproducibilidad es la producción y la dilución de las poblaciones bacterianas. Es importante que antes de comenzar el ensayo se determina la dilución de las poblaciones bacterianas como éxito de ensayo es dependiendo de la constante producción de controles A y B tener recuentos de UFC con un promedio de ~ 120 UFC por punto. Para obtener puntos que son contables por el software, también es imprescindible que la técnica utilizada para las bacterias de la placa es ejecutada con éxito. La deposición de la solución bacteriana y la inclinación de la placa de modo que puntos run ~ 2-3 cm es crítico para la producción de colonias de la distribución correcta y el tamaño justo para cuenta exacta por el buen software. Dominar todos estos pasos se asegurarán de que los resultados precisos y consistentes son producidos por este protocolo

Incluso cuando se ejecutan todos los pasos críticos bien puede todavía haber casos donde es necesario modificar o solucionar este protocolo. Modificaciones de este protocolo para evaluar otras bacterias pueden requerir la optimización de la noche a la mañana LBA placa temperatura de incubación, para la formación de micro-colonias. Otras cepas de bacterias o anticuerpo fuentes, que no sea suero, pueden requerir optimización de la concentración de complemento. Valores NSK y KIs de sueros de control también deben ser vigilado para asegurar que el ensayo está trabajando apropiadamente. NSK no subiera más 70%. El KI de control sera no debe variar más de media ± 2SD. Para lograr resultados acertados y coherentes cuando se utiliza este protocolo, será necesario llevar a cabo todos los pasos como se describe aquí con especial atención a los pasos críticos señalados anteriormente.

Si bien este protocolo llena una importante necesidad en la comunidad de investigación de Shigella , no está sin sus limitaciones. Este protocolo se basa en materiales biológicos y, por tanto, siempre será cierta variabilidad que es difícil de controlar. Variaciones en la actividad del complemento de diferentes lotes y fuentes pueden contribuir a la variabilidad en los ensayos. Para mitigar esto, es importante manejar adecuadamente complemento y prueba de los lotes nuevos de complemento para la actividad antes de la compra. También puede ser útil crear piscinas de lotes de complemento con actividad conocida para tener un suministro homogéneo. Este protocolo es simple por su diseño y no requiere ningún equipo especializado y la Colonia automatizada enumerando software está libremente disponible. Aunque esta simplicidad es una ventaja, permitiendo a este protocolo a ser utilizado en prácticamente cualquier laboratorio, todavía requiere una incubación durante la noche. Ensayos recientes han descrito que tiene mucho requerimiento de incubación más corto, pero que requieren reactivos especializados, preparatoria15. Otra limitación de este ensayo es que en su forma actual sólo es capaz de investigar a la vez una sola especie bacteriana. En la shigelosis hay un deseo de crear una vacuna multivalente, y tener Ensayos inmunológicos que pueden determinar el patógeno de una manera multiplex es de gran valor. Este análisis podrían modificarse en el futuro para satisfacer esta necesidad, pero en su forma actual, es un ensayo único-plex.

Mientras que esta prueba tiene algunas limitaciones, todavía tiene muchas ventajas sobre los métodos existentes o alternativos. Estas ventajas incluyen muchas mejoras que se combinan para hacer la ejecución de este método requiere mucho menos mano de obra y de más alto rendimiento que el tradicionales SBAs. El uso de las poblaciones bacterianas congelados, un formato de ensayo de placa de 96 pocillos, la chapa en los platos de petri cuadradas más grandes, la coloración de las colonias que permite fotografiar y Colonia-cuenta automática, ayudan a reducir los materiales y el tiempo necesario para completar este ensayo. Este ensayo también tiene ventajas sobre otros métodos de alto rendimiento porque no requiere equipo ni reactivos especializados. El protocolo descrito puede realizarse con los reactivos básicos y software disponible gratuitamente, lo que permite su aplicación en cualquier entorno de laboratorio.

Todas las ventajas que ofrece este protocolo admite su uso en muchas investigaciones futuras. El ensayo es ideal para el examen de las respuestas inmunes después de la vacunación o infección natural. Esta aplicación permite la SBA ser una herramienta valiosa en la investigación de vacunas de Shigella y ya se ha utilizado para evaluar la inmunogenicidad de la vacuna en Shigella bio-conjugado vacunas donde se ha demostrado la capacidad de las vacunas a inducir la producción de anticuerpos funcionales16. Este protocolo ha sido ampliamente probado por varios laboratorios y se ha demostrado para producir resultados confiables y reproducibles9. Este protocolo también produce resultados comparables cuando las mismas muestras se prueban usando otros ensayos bactericidas17. La consistencia en los datos generados por este ensayo, y su compatibilidad con otros métodos antiguos, es una herramienta robusta para evaluar con precisión la actividad bactericida en muestras de suero. El ensayo también fácilmente puede ser adaptado para evaluar tipos de muestras adicionales. Mientras que el suero está disponible en ensayos clínicos de adultos, puede ser difícil obtener suficiente suero en ensayos centrados en bebés y niños pequeños; una de las poblaciones objetivo eventual para vacunas contra Shigella . En estos ensayos, sangre es habitualmente recogida en papel de filtro y secada. Ha habido algunos éxitos preliminares con este tipo de formato de muestra con el SBA. Además de sangre, muestras de mucosa (como saliva, extractos fecales y orina) son también un objetivo que es relevante en la investigación de vacunas de Shigella . Actualmente, este protocolo se ha evaluado para tres de los serotipos más clínicamente relevantes de Shigella pero también puede ser adaptado para adicional Shigella spp., así como otras bacterias patógenas. Trabajo futuro se centrará en la producción de un ensayo múltiple con muchas de las mismas características que el ensayo descrito por este protocolo. Un análisis multiplexado permite evaluación de múltiples serotipos de Shigella simultáneamente, conservar más volúmenes de muestra y de las manos el tiempo de ensayo. También hay trabajos en marcha para transferir este análisis a laboratorios en todo el mundo. Estas evaluaciones globales generará más datos para calificar el ensayo a mayor escala de investigación, mientras que al mismo tiempo aumentar el número de laboratorios de Microbiología e Inmunología que tienen acceso a este SBA evaluar bacterias y suero muestras recogidas de diferentes localidades endémicas. El ensayo descrito aquí es simple y de alto rendimiento y tiene la capacidad de mejorar la evaluación inmunológica en el campo de Shigella , así como aplicaciones más amplias para la evaluación de otras bacterias patógenas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por una subvención de camino a M.H.N. Este estudio se llevó a cabo una investigación cooperativa y desarrollo acuerdo entre el Instituto de investigación Walter Reed ejército y la Universidad de Alabama en Birmingham.

Materials

Gelatin Sigma G9391 Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) Sigma T8877 ≥98.0% (HPLC)
Sodium azide (NaN3) Sigma S2002 ≥99.5%
Baby Rabbit Complement PelFreez 31061-3 3-4 week old
HBSS with Ca2+/Mg2+ Invitrogen 14065-56 Without Phenol Red
LB Agar (Lennox) Sigma L2897 Powder microbial growth medium
Bacto Agar BD 214010 Powdered, (C12H18O9)n
Glycerol Sigma G5516 For molecular biology, ≥99%
LB Broth (Lennox) Sigma L3022 Powder microbial growth medium
Square Petri Dish Sigma Z617679-240EA 120 mm x 120 mm
Assay Plate Costar 3799 96 well u-bottom plate with lid
NICE Software University of Alabama at Birmingham ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/
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References

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Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).
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