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Immunology and Infection

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59164
, , ,
1Department of Enteric Infections, Bacterial Diseases Branch,Walter Reed Army Institute of Research, 2University of Alabama at Birmingham

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Messung der Shigellacidal Aktivität der Antikörper im Serum. Serum mit Bakterien und exogene Ergänzung, inkubiert, vermischt und das Reaktionsgemisch auf Agarplatten überzogen ist. Lebensfähige Bakterien bilden Kolonien, die gezählt werden, einen automatisierten Kolonie Enumerator verwenden und die bakterizide Titer bestimmt.

Abstract

Serum bakterizide Assays (SBAs) messen die funktionelle Aktivität der Antikörper und werden seit vielen Jahrzehnten. SBAs Messen direkt Antikörperaktivität Tötung durch die Bewertung der Fähigkeit von Antikörpern im Serum an Bakterien zu binden und Ergänzung zu aktivieren. Diese Ergänzung Aktivierung führt zur Lyse und Tötung von der Ziel-Bakterien. Diese Tests sind wertvoll, weil sie das Antikörper-Produktion um die biologischen Funktionen zu erhellen, die diese Antikörper haben, so dass Forscher, die Rolle zu studieren, die Antikörper spielen können, um Infektion zu verhindern, Quantifizierung hinausgehen. SBAs verwendet wurden, um Immunantworten für viele menschliche Krankheitserreger zu studieren, aber im Moment gibt es keine allgemein anerkannte Methode für Shigella . Historisch, SBAs sehr arbeitsintensiv gewesen erfordern viele zeitaufwendige Schritte, um die Überlebende Bakterien genau zu quantifizieren. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, robuste, und Hochdurchsatz-assay, dass Maßnahmen funktionalen Antikörper spezifisch für Shigella in in-vitro-Serum. Die hier beschriebene Methode bietet viele Vorteile gegenüber traditionellen SBAs, einschließlich der Verwendung von gefrorenen bakterielle Aktien, 96 gut assay, Platten, Mikro-Kultursystem und automatisierte Koloniezahlbestimmung. Weniger arbeitsintensiv und Hochdurchsatz-machen alle diese Änderungen dieser Assay. Dieses Protokoll ist einfacher und schneller durchzuführen als traditionelle SBAs während immer noch mit einfachen Technologien und Reagenzien zur Verfügung. Das Protokoll erfolgreich in mehreren unabhängigen Labors angewendet wurde und der Test ist robust und reproduzierbar. Der Test lässt sich Immunantworten in präklinische sowie klinische Studien zu beurteilen. Quantifizierung der Shigellacidal Antikörper-Titer sowohl vor als auch nach der Antigen-Exposition (entweder durch Impfung oder Infektion) ermöglicht ein umfassenderes Verständnis der wie funktionale Antikörper Antworten generiert werden und ihren Beitrag zu schützende Immunität. Die Entwicklung dieses standardisiert, gut charakterisierten Assay kann Shigella Impfstoff Design erheblich erleichtern.

Introduction

Shigella Serotypen, Shigella Flexneri 2a und 3a S. Flexneri S. Sonnei zeigen epidemiologische Prävalenz weltweit. Die Durchfallerkrankungen durch diese Shigella Spezies Auswirkungen Militär, Reisende1verursacht und ist eine führende Ursache von Durchfallerkrankungen Todesfälle bei Kindern unter dem Alter von 5 in Entwicklungsländern2. Derzeit gibt es keine zugelassenen Impfstoffe zum Schutz vor Shigella, allerdings gibt es mehrere Kandidaten Impfstoffe in verschiedenen Stadien der Entwicklung. Viele von diesen Impfstoffen und anderen prophylaktischen Maßnahmen derzeit in Entwicklung, konzentrieren sich auf Antikörper gegen Shigellen Lipopolysaccharid (LPS) produziert. LPS ist eine attraktive Impfstoffkandidat, denn es ist ein großer Oberflächenantigen und natürliche Infektion mit Shigellen induziert LPS-spezifische Antikörper, die Schutzfunktion gegen Reinfektion Serotyp-spezifisch sein können. Daher müssen ein erfolgreiche Shigella -Impfstoff wahrscheinlich sein Multi-Valent und Ziel 3-4, die Shigellen Serotypen induzieren Immunität gegen 70-80 % der weltweit zirkulierenden Stämme3,4, 5 , 6. Dies erfordert, dass Assays auszuwertende Shigella Impfstoffkandidaten spezifisch für mehrere verschiedene Serotypen.

Aktuellen immunologischen Assays für die Bewertung der Impfstoffkandidaten konzentrieren sich auf Ebenen der Antikörpertiter zu quantifizieren, aber es gibt einige gut charakterisierten Assays, funktionale Antikörper zu bewerten. Die Prüfung der Funktionsfähigkeit der Antikörper ist wichtig, denn Erreger spezifische Antikörper verantwortlich sind für die Bekämpfung der Infektion durch eine Reihe von Funktionsmechanismen einschließlich bindende Bakterien Oberflächenantigenen und Adhäsion zu verhindern und Infektion der Epithelzellen, gegen bakterielle Zellen oder Opsonization und Phagozytose, und direkt töten Krankheitserreger durch Bindung und Einleitung der Komplementkaskade. Die direkte Tötung von Bakterien durch Antikörper tritt auf, wenn Antikörper an Bauteilen der Ziel-Bakterien binden und Einleitung der Komplementkaskade führt zur Aktivierung des viele Zymogens, dass letztlich führen zu Porenbildung in die bakterielle, die Zelle lyse und bakterielle Tod führt. Diese direkte Tötung von Bakterien durch zirkulierende Antikörper und Ergänzung kann eine entscheidende frühe Linie der Verteidigung während der Infektion sein.

Personen, die infiziert sind, natürlich haben Antikörper mit Shigellacidal Aktivität in ihren Sera. Diese Shigella –spezifische Antikörper wurden erkannt, mit traditionellen Ergänzung-vermittelten Tötung 7,8Proben. Dies bedeutet, dass es möglicherweise eine Rolle für bakterizide Antikörper im Schutz gegen Shigellen. Traditionelle bakterizide Assays sind einfach in ihrer Ausführung: Serum ist Hitze-inaktivierten (, endogene Komplementaktivität zu zerstören) und gemischt mit den Bakterien von Interesse. Diese Mischung in einer bestimmten Konzentration wird exogene Ergänzung hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch ist um bakteriellen Tötung ermöglichen inkubiert und dann vergoldet um Koloniebildenden Einheiten (KBE) zu bestätigen. Sobald KBE ausgezählt sind, ein 50 %-Tötung-Index (KI) berechnet werden kann und ein SBA-Titer bestimmt. Während dieses Verfahren relativ einfach ist, können diese Tests arbeitsintensiv und zeitaufwändig durchzuführen und die Ergebnisse können sehr unterschiedlich sein. Neben dieser Einschränkungen gibt es keine gut charakterisierten funktionelle Assays derzeit für Shigella. Daher haben wir erfolgreich entwickelt und qualifiziert einen einfachen, Hochdurchsatz-Assay, Shigella bakterizide Aktivität für drei der klinisch relevanten Stämme9zu messen. Dieses Protokoll beschreibt eine SBA mit Änderungen, die Assay Effizienz und Reproduzierbarkeit zu verbessern. Die erste dieser Änderungen ist die Verwendung von gefrorenen bakterielle Aktien. Die Herstellung von einmaligen Gebrauch Aktien entfällt Kultur frische Bakterien für jedes Assay gleichzeitiger Reduzierung der Assay-Assay Variabilität. Eine andere Zeit und Arbeit sparen Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von einem 96-Well-Platte-Assay-Format. Dies ermöglicht für serielle Verdünnung von Proben, so dass eine Reihe von Konzentrationen getestet werden kann.  Es ermöglicht auch die Verwendung von Mehrkanal-Pipetten für Galvanik Proben auf quadratische Petrischalen. Wenn diese quadratische Petrischalen in Verbindung mit einem Kultursystem, die Mikro-Kolonien produziert verwendet werden, sinkt die Zahl der Agarplatten für den Assay erforderlich. Dies ermöglicht in Kombination mit frei verfügbaren Koloniezahlbestimmung Software, ursprünglich entwickelt für die Pneumokokken Multiplex Opsonophagocytic töten Assay (MOPA)10, für die schnelle, automatisierte und zuverlässige Kolonie-Enumeration. All diese Verbesserungen deutlich reduzieren Hands-on-Test-Zeit und erstellen ein Hochdurchsatz-System für mehrere Platten auf einmal ausgeführt werden.

Während dieses Protokoll für drei der klinisch relevanten Serotypen von Shigella, optimiert worden ist, die SBA hier beschrieben, kann leicht auf viele andere bakterielle Erreger angewendet werden. Neben diesem Protokoll potenzielle Nutzung mit anderen Bakterien hat dieses Protokoll das Potenzial zu erweitern, über die Verwendung nur Serum als Ausgangsmaterial, die die Analyse der Antikörper in anderen relevanten Probentypen wie Schleimhaut-Proben enthalten könnte, einschließlich der Speichel und Stuhlproben. Die Verwendung des Assays zu untersuchen, immunologische Reaktionen nach der Impfung kann breiter Einblick in Immunantworten durch Impfung führt zu das rationale Design von Impfstoffen erzeugt, und Hilfe für das Verständnis der wie natürliche Immunität entwickelt.

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des menschlichen Subjekts WRAIR Protection Board. In dieser Studie verwendete Proben sind humanem Serumproben im Rahmen des WRAIR Protokollnummer 1328, in Übereinstimmung mit allen institutionellen und staatlichen Richtlinien über den Schutz der Versuchspersonen. Proben wurden anonymisierte, und die Verwendung dieser anonymen Proben wurde als nicht-menschliche Thema-Forschung von der UAB IRB (Protokoll-Nummer N150115001) eingestuft. 1. bereiten Sie Assay Reagenzien Bereiten Sie 1 % Gelatine durch Zugabe von 1 g Gelatine, 100 mL Wasser. Autoklaven und bei Raumtemperatur lagern. 100 mg/mL Stammlösung TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium-Chlorid) vorbereiten (1, 000 X) durch Zugabe von 5 g des TTC in 40 mL Wasser. Wenn die TTC vollständig gelöst ist, stellen Sie die Lautstärke auf 50 mL Wasser mit Sterilfilter mit 0,2 µm-Filter. Die Lösung bei 4 ° C lagern und vor Licht schützen.Hinweis: TTC koloriert die Bakterienkolonien und macht sie viel leichter zu zählen. TTC-Lösung hat eine leichte gelbe Farbe. Wenn TTC Lösung eine rote Farbe entwickelt, verwerfen und frisch zubereiten. Bereiten Sie 10 % Natrium-Azid (NaN3) Stammlösung (100 X vor) durch Zugabe von 5 g NaN3 bis 40 mL Wasser. Fügen Sie nach vollständiger Auflösung Wasser bis 50 mL hinzu. Bei Raumtemperatur lagern.Vorsicht: Natriumazid ein Gift und kann giftig sein, wenn die aufgenommenen oder Absorption durch die Haut oder den Augen. Es kann mit Blei und Kupfer Klempnerarbeit hochexplosiv Metall Azides bilden reagieren. Zur Entsorgung von Reagenzien mit Natriumazid spülen Sie mit einem großen Volumen von Wasser zu verhindern Azid Aufbau oder in einer Tasche Biohazard zu verwerfen. Bereiten Sie LBA Platte (LB-Agar-Platte vor) durch Zugabe von LB-Agar 35 g auf 1 L Wasser und Autoklaven. Jede quadratische Petrischale (120 x 120 mm2) 25 mL hinzufügen. Inkubieren Sie Platten bei RT für 10-20 min zu Agar zu erstarren lassen. Setzen Sie Platten wieder in Plastiktüten und Store bei 4 ° C für bis zu 1 Monat. Overlay-Agar durch Zugabe von 7,5 g Agar, 1.000 mL Wasser und Autoklaven vorbereiten. Brüten Sie in 56 ° C Wasserbad bis benötigt. Direkt vor dem Gebrauch, fügen Sie 1 mL 100 mg/mL TTC und 10 mL 10 % NaN3 und gut mischen.Hinweis: Jeder LBA-Platte braucht 25 mL der Overlay-Agar. Overlay Agar kann bis zu einen Monat im Voraus vorbereitet und in der Mikrowelle oder auf einer Heizplatte geschmolzen, Bedarf für den Assay. Sicherstellen Sie, dass Agar Temperatur ~ 55 ° C vor der Anwendung auf LBA Platten. Bereiten Sie Testpuffer durch Zugabe von 5 mL der 10 X Hanks ausgewogen Salz Lösung (HBSS) mit Ca2 +/Mg+ 2 und 5 mL 1 % Gelatine, 40 mL Wasser zu. Bei Raumtemperatur lagern. 2. bereiten Sie ergänzen und gezielt Bakterien Bereiten Sie Baby Kaninchen Ergänzung (BRC)Hinweis: Detaillierte Kriterien für Ergänzung viel Auswahl Sie hier finden: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf Gefrorene BRC zu erhalten und mit fließendem kalten Wasser auftauen. Physisch mischen die BRC alle ~ 10-20 min bis vollständig aufgetaut. Unterliegen Sie BRC nicht wiederholtes Einfrieren Auftauen Zyklen. Während BRC Auftauen beschriften Sie 1,5 mL, 5mL oder 15 mL Zentrifuge Röhren. Platz mit der Bezeichnung Rohre auf Eis zum Vorkühlen. Aliquoten richtige Lautstärke BRC auf die vorgekühlte Zentrifuge Rohre (nach dem Befüllen sofort zurück jedes Rohr auf dem Eis). Aliquote bei ≤-70 ° C im Gefrierschrank aufbewahren.Hinweis: Für jedes Assay-Platte ist ca. 1 m Ergänzung erforderlich. Ergänzung Aliquote sind für den einmaligen Gebrauch und regelmÄÑig in Bänden zu Layouts bestimmen soll. Um Hitze-inaktivierten BRC vorzubereiten, Tauwetter ein Aliquot des aktiven BRC. 56 ° C Wasserbad vorbereiten. Nach BRC vollständig aufgetaut ist, überträgt es auf das Wasserbad und 30 min inkubieren. Nach der Inkubation Hitze-inaktivierten BRC aus dem Wasserbad nehmen und bei RT für 10-15 min. Mischung kräftig, abkühlen lassen und aliquoten ~ 150 µL bis 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Speichern Aliquote bei ≤-10 ° C. Ziel Bakterien Lager vorbereitenHinweis: Das folgende Verfahren wird verwendet, um 48 Aliquote der Sollbestand Bakterien vorzubereiten; ggf. weitere Aliquote des Protokolls kann hochskaliert werden. Entfernen Sie die Bakterien Meister Lager Fläschchen aus dem Gefrierschrank und kratzen die bakterielle Eisfläche um eine kleine Menge des Eises aus dem Fläschchen auf eine Blut Agarplatte zu entfernen. Sofort das master Lager Fläschchen zurück in den Gefrierschrank. Durchziehen Sie dieser kleine aliquoten bakterielle Lager auf das Blut Nährbodenplatte und Abdeckung mit der Platte Deckel. Inkubieren Sie die Platte auf dem Kopf stehend über Nacht in 37 °C/5% CO2 Inkubator. Übertragen Sie ~ 10 isolierte glatte Kolonien auf eine 50 mL-Tube mit 30 mL LB Brühe. 3-5 h bei 37 ° C mit sanft schütteln, bis die Brühe Kultur ein OD600 ~0.6-0,7 hat inkubieren. Ernten Sie oben 12,5 mL der Kultur und der Übertragung auf eine frische 50 mL-Tube. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 15.000 X g für 2 min mit einer Tischplatte Mikro-Zentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand und erneut aussetzen Sie das Pellet in 25 mL 15 % sterile Glycerin-lb. Gut mischen und 0,5 mL Aliquots in sterilen 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren (~ 48 Röhren) zu verzichten. Aliquote bei ≤-70 ° C im Gefrierschrank aufbewahren. Bestätigen Sie die bakterielle Identität mit dem Agglutination Test vor dem Gebrauch. Bestimmung der optimalen Verdünnungsfaktor für Bakterien SollbestandHinweis: Jede Charge von Bakterien Sollbestand muss im Assay-Bedingungen zu bestimmen, die Verdünnung notwendig, ~ 120 KBE/Spot auf LB-Platten ergeben titriert werden. Erhalten einer Mikrotiterplatte (Verdünnung Platte) und fügen Sie 135 µL Testpuffer 1A gut. Fügen Sie 120 µL Assays Butter, Brunnen 1 b – 1H. Entfernen Sie ein Fläschchen mit gefrorenem Ziel Bakterien aus der Tiefkühltruhe und bei Zimmertemperatur auftauen. Fügen Sie 15ul der aufgetauten bakterielle Lager 1A um ein 10-divisibel Verdünnung der bakteriellen Aktie machen gut. Übertragen Sie 30 µL bakterielle Lösung von gut 1A auf gut 1 b eine 5-fold serielle Verdünnung durchführen. Weiter 5-fold Verdünnungsreihen um gut 1 H für insgesamt 8 Verdünnungen (01:10 01:50 1: 250, 1:1 250; 1:6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250). Erhalten Sie ein weiteres Mikrotiterplatte (Assay-Platte) und fügen Sie 20 µL Testpuffer, alle gut in den Spalten 1 und 2 in der Assay-Platte. 10 µL verdünnter Bakterien aus jedem Brunnen in Spalte 1 der Verdünnung Platte in die entsprechenden Vertiefungen in den Spalten 1 und 2 der Assay-Platte zu übertragen. 10 µL des Bakteriums ist aus gut 1A der Verdünnung Platte in gut 1A und 2A in der Assay-Platte, etc. übernommen. Weiter mit dem Assay im Serum bakterizide Assay (SBA) unten für Strg A-Control B Schritte 3.6-3.12 beschrieben. Nachdem die Platten auf Eis inkubiert worden, verwenden einer Mehrkanal-Pipette mit 8 Pipettenspitzen, 10 µL aus den Brunnen in Spalte 1 auf eine LBA-Platte vor Ort. Auch, vor Ort die Brunnen aus Spalte 2 auf die LBA-Platte. Weiter mit dem Assay wie unter 3.14-4.6 beschrieben. Bestimmen Sie die Bakterien-Verdünnung, die ~ 120 KBE/Spot Control b ergibt, diese Verdünnung wird in der Probe verwendet werden. 3. Serum bakterizide Assay (SBA) Hinweis: Das unten beschriebene Verfahren ist für eine Test-Platte, aber die Zahl der Assay-Platten. Wärme zu inaktivieren Prüflinge durch Inkubation Proben im Wasserbad 56 ° C für 30 Minuten.Hinweis: Prüflinge müssen Hitze-inaktivierten vor der Prüfung, endogenen Komplementaktivität aufzuheben sein. Dies kann vor dem Assay und inaktivierte Proben erneut eingefroren oder gespeichert bei 4 ° C bis getestet werden können. Erhalten ein Assay-Platte und die Spalten 1 bis 12 Reihen A bis G. hinzufügen 20 µL Testpuffer Spalten 1 und 2 der Reihe H 20 µL Testpuffer hinzufügen, siehe Tabelle 1. Laden Sie 30 µL jeder Probe in zweifacher Ausfertigung zu Reihe H der Assay-Platte. Z. B. 30 µL der Probe 1 in Vertiefungen 3 H und 4 H zu verzichten, und 30 µL der Probe 2 in Brunnen, 5 H und 6 H, etc. zu verzichten. Führen Sie 3-fold Verdünnungsreihen Proben mit einer Mehrkanal-Pipette. 10 µ der Probe aus Brunnen 3H – 12H und Transfer zum entsprechenden Brunnen in Reihe G entfernen und mischen die Probe gut von oben und unten Pipettieren 8-10 Mal. Dann entfernen Sie 10 µ aus Brunnen 3G – 12G und Transfer in entsprechenden Vertiefungen in Reihe F und mischen Sie gut. Diese Verdünnungsreihen durch Zeile A. weiter Nach dem Mischen der Brunnen in Reihe A, entfernen Sie und entsorgen Sie 10 µl von Brunnen 3A-12A, so dass alle Brunnen 20 µl enthalten.Hinweis: Da 20 µL Serum in einem Gesamt-Assay-Volumen von 80 µL verwendet wird, gibt es eine 4-fold zusätzliche Verdünnung in der Probe. Diese Verdünnung muss bei der Berechnung des SBA-Titer berücksichtigt werden die Verdünnung des Serums mit 4 multipliziert. Zum Beispiel, wenn ab Verdünnung von 1:2 verwendet wird, ist die tatsächliche Verdünnung getestet 1:8. Eine Durchstechflasche von gefrorenen Sollbestand Bakterien und Auftauen bei Raumtemperatur zu entfernen. Verdünnen Sie die Bakterien in 20 mL Testpuffer nach den vorgegebenen optimalen Verdünnungsfaktor (dieser Verdünnungsfaktor wurde in Abschnitt 2.3ermittelt). Fügen Sie 10 µL verdünnter Bakterien in jede Vertiefung der Assay-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette. Entfernen Sie eine Durchstechflasche von gefrorenen BRC und eine Durchstechflasche, Hitze-inaktivierten BRC, Auftauen bei Raumtemperatur unter fließendem kalten Wasser eingefroren oder platzieren Sie auf dem Rost eine biologische Sicherheit Schrank mit Einblasen von Luft schnell auftauen. Bereiten Sie eine 20 % ige Lösung von Hitze-inaktivierten BRC. Mix 100 µL der Hitze-inaktivierten BRC mit 400 µL Testpuffer. Alle Brunnen in Spalte 1 (Control A Brunnen) 50 µL dieser 20 % Hitze-inaktivierten BRC Lösung hinzufügen.Hinweis: Hitze-inaktivierten BRC wird als Steuerelement verwendet, um unspezifische Tötung (NSK) in der Probe zu überwachen. Bereiten Sie eine 20 % ige Lösung von native BRC. Mischen Sie 1 mL der native BRC mit 4 mL Testpuffer. Alle Brunnen in den Spalten 2 bis 12 (B Kontrolle und Test Probe Brunnen) 50 µL dieser Mischung hinzufügen.Hinweis: Die Endkonzentration von BRC im Reaktionsgemisch beträgt 12,5 %. Kurz mischen Sie Assay Platte durch Schütteln sanft für 10-15 s auf einem Teller Shaker oder mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 8 Mal mit einer Mehrkanal-Pipette pipettieren. Setzen Sie die Assay-Platte in 37 ° C mikrobiologische Inkubator für 2 h (ohne schütteln). 2 LBA Trockenplatten indem Sie entfernen Deckel und Platten stellen in biologischen Sicherheitsschrank für 40-60 min. Nach Abschluss die 2 h Inkubation bewegen der Assay-Platte nass Eis und inkubieren Sie für 10-20 min, um die Reaktion zu stoppen. Mit einer 12-Kanal-Pipette, mischen Sie die Brunnen in Reihe H und vor Ort Platte 10 µL des Reaktionsgemisches auf die Unterseite eines LBA-Platte. Sofort die Platte kippen und die Spots für ~1.5-2 cm. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Zeile G, F und E, spotting sie oberhalb der vorherigen Zeile auf der LBA-Platte laufen lassen. Reihe E, F, G und H sind gesichtet, auf die LBA-Platte, und Zeile A, B, C, und D auf die gleiche Weise auf einen zweiten Teller LBA gesichtet werden, siehe Abbildung 1. Inkubieren Sie die LBA-Platten bei Raumtemperatur, bis die Lösung in den LBA-Platten (10-15 min) adsorbiert wird. Setzen Sie den Deckel auf den LBA-Platten und die LBA-Platten in der mikrobiologischen Inkubator Kopf über Nacht inkubieren (~ 16-18 h). S. Flexneri 2a und 3a bei 29 ° C inkubieren und inkubieren Sie S. Sonnei ist bei 26 ° C.Hinweis: Diese Temperaturen ergeben kleinere “Mikro-Kolonien” mit Größen passend für präzise Zählung durch eine Kolonie Zähler9. Hinzugeben Sie nach der Inkubation über Nacht 25 mL Overlay-Agar (bei ~ 55 ° C), enthält 100 µg/mL TTC und 0,1 % NaN3 auf jede Platte LBA. Inkubieren Sie die LBA-Platten bei 37 ° C für 2 h erlauben die überlebenden Bakterien entwickeln rot, siehe Abbildung 1 unten. Platten mit einer Digitalkamera zu fotografieren und Bilder auf einen Computer übertragen, dem der NIST integrierte Kolonie Aufzählung Software (Nizza) installiert wurde, siehe Abbildung 2.Hinweis: SCHÖNE Koloniezahlbestimmung Software ist kostenlos erhältlich. Siehe Liste der Materialien für Details und Installationsanleitung. 4. Graf bakterielle Kolonien Open-schön-Software und Eingabe Benutzername, Experiment Informationen und beliebige assay Notizen in die leeren Felder. Nach Eingabe dieser Daten klicken Sie auf die Schaltfläche ” fertig “. Importieren Sie fotografierte Platten, indem Sie auf die Schaltfläche Öffnen und auswählen der richtigen Dateien vom Computer. Passen Sie die Assay Parameter, indem Sie die Anzahl der Zeilen auf 4 und die Anzahl der Spalten bis 12. Passen Sie die Hintergrundeinstellung zu-3 Sigma und die Auflösung zu niedrig. Siehe Abbildung 2. Bewegen Sie die Regionen von Interesse (ROIs) durch Klicken und ziehen, so dass jeder ROI direkt über eine Probe vor Ort. Sicherstellen Sie, dass alle Bakterienkolonien im Inneren der ROI ohne Überschneidungen zwischen beiden Stichproben. Sobald eine Platte abgeschlossen ist, doppelklicken Sie auf die nächste Platte in der Liste gespeicherte Daten Bilder und passen Sie des ROIs an. Siehe Abbildung 2. Wenn alle Platten eingestellt haben, klicken Sie auf die grüne Schaltfläche , siehe Abbildung 2 und Abbildung 3. Wenn zählen abgeschlossen ist klicken Sie auf exportieren , um die Daten im.xls/.xlsx-Format zu exportieren. Benennen Sie und speichern Sie die Datei.xls/.xlsx für die Datenanalyse. Ordnen Sie Daten in einer Tabellenformat exportiert, damit zählt in einer Tabelle, die Vertretung der Assay 96-Well-Platte organisiert sind, siehe Tabelle 2. 5. berechnen Sie SBA-Titer (KI) und unspezifische Tötung (NSK) Hinweis: SBA-Titer oder Tötung Index (KI) ist definiert als der Kehrwert der Serum-Verdünnung, das 50 % der Ziel-Bakterien abtötet. Berechnen Sie die 50 % töten Index (KI)-cutoff-Wert von durchschnittlich die KBE aktive Ergänzung Kontroll-Vertiefungen (Control B) und durch 2 dividiert. Berechnen Sie die durchschnittliche KBE für jede Verdünnung der Samples, die doppelt ausgeführt wurde, siehe Tabelle 3. Weil eine Serum-Verdünnung selten genau diese 50 %-KI-Wert führen, werden von zwei sequentielle Serum Verdünnungen, eine, die weniger als 50 % tötet und eine, die mehr als 50 % tötet interpoliert werden kann, siehe Abbildung 4. Die Formel zur Berechnung der interpolierten SBA-KI ist nachfolgend dargestellt:Hinweis: Die bakterizide Titer oder KI, kann auch automatisch mit Opsotiter Software entwickelt von UAB berechnet werden. Wenden Sie auf Anfrage Opsotiter sich an Dr. Moon Nahm oder Mr Rob Burton. Siehe https://www.vaccine.uab.edu für Kontaktinformationen. Die NSK-Wert zu berechnen, indem man 1 minus dem Durchschnitt von Steuerung B dividiert durch die durchschnittliche Kontrolle A.

Representative Results

Eine 96-Well-Platte-Layout in einem typischen Assay verwendet zeigt sich in Tabelle 1. Dieses Layout hat die aktive Ergänzung Kontroll-Vertiefungen (Control B), die Hitze-inaktivierten Ergänzung Kontroll-Vertiefungen (a-Steuerung) und fünf Proben in zweifacher Ausfertigung. Proben sind serienmäßig 3-fach verdünnt oben die Platte aus Zeile H Rudern ein erlaubt für 8 Verdünnungen der Samples auf einmal getestet werden. Abbildung 1 zeigt zwei LBA Platten nach der Übernachtung Inkubation und Overlay-Zugabe. Farbentwicklung stattgefunden hat und alle Überlebende Kolonien werden in rot angezeigt. Bakteriellen Tötung ist deutlich zu sehen für alle Proben in den ersten drei Verdünnungen (Zeilen F-H) getestet und als Proben verdünnt sind weiter oben in der Platte, eine Abnahme der bakteriellen Tötung gesehen wo Serum weniger konzentriert ist. NETTE Software-Schnittstelle ist in Abbildung 2ersichtlich. Mikro-Kolonie Grafen aus die schöne Software können in Abbildung 3zu sehen, und diese Zählungen sind in Tabelle 2organisiert worden. Die Anzahl der durchschnittlichen KBE für jede Verdünnung von jeder Probe wird berechnet und ein 50 %-KI-Wert errechnet sich in Tabelle 3. Dieser 50 %-KI-Wert kann auf die gemittelten KBE für jedes Serum Verdünnung zur Bestimmung der Werte zur Berechnung der SBA-KI nach der Formel, die in Abbildung 4beschrieben angewendet werden. Das endgültige Ergebnis des Tests ist in Tabelle 4dargestellt. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Steuerung A Steuerung B Verdünnung 8 Verdünnung 8 Verdünnung 8 Verdünnung 8 Verdünnung 8 Verdünnung 8 Verdünnung 8 Verdünnung 8 Verdünnung 8 Verdünnung 8 B Steuerung A Steuerung B Verdünnung 7 Verdünnung 7 Verdünnung 7 Verdünnung 7 Verdünnung 7 Verdünnung 7 Verdünnung 7 Verdünnung 7 Verdünnung 7 Verdünnung 7 C Steuerung A Steuerung B Verdünnung 6 Verdünnung 6 Verdünnung 6 Verdünnung 6 Verdünnung 6 Verdünnung 6 Verdünnung 6 Verdünnung 6 Verdünnung 6 Verdünnung 6 D Steuerung A Steuerung B Verdünnung 5 Verdünnung 5 Verdünnung 5 Verdünnung 5 Verdünnung 5 Verdünnung 5 Verdünnung 5 Verdünnung 5 Verdünnung 5 Verdünnung 5 E Steuerung A Steuerung B Verdünnung 4 Verdünnung 4 Verdünnung 4 Verdünnung 4 Verdünnung 4 Verdünnung 4 Verdünnung 4 Verdünnung 4 Verdünnung 4 Verdünnung 4 F Steuerung A Steuerung B Verdünnung 3 Verdünnung 3 Verdünnung 3 Verdünnung 3 Verdünnung 3 Verdünnung 3 Verdünnung 3 Verdünnung 3 Verdünnung 3 Verdünnung 3 G Steuerung A Steuerung B Verdünnung 2 Verdünnung 2 Verdünnung 2 Verdünnung 2 Verdünnung 2 Verdünnung 2 Verdünnung 2 Verdünnung 2 Verdünnung 2 Verdünnung 2 H Steuerung A Steuerung B Verdünnung 1 Verdünnung 1 Verdünnung 1 Verdünnung 1 Verdünnung 1 Verdünnung 1 Verdünnung 1 Verdünnung 1 Verdünnung 1 Verdünnung 1 Beispiel 1 Beispiel 2 Beispiel 3 Probe 4 Probe 5 Tabelle 1: Assay Platte Layout. Spalten 1 und 2 beinhalten die Komplement-Kontroll-Vertiefungen. Steuerung A befindet sich in Spalte 1 und ist der Hitze-inaktivierten Kontrolle, mit SBA Puffer, Bakterien und Hitze-inaktivierten Ergänzung zu ergänzen. Steuerung B befindet sich in Spalte 2 und ist das aktive Steuerelement, mit SBA-Puffer, Bakterien und Ergänzung zu ergänzen. Spalten 3-12 Serumproben. Jede Probe ist doppelt und 3-Fach seriell verdünnt aus Reihe H, Reihe A laufen Abbildung 1: LBA Platten nach Farbentwicklung. Repräsentative S. Flexneri 3a Mikro-Bakterienkolonien geworden über Nacht auf die entsprechende Größe. Overlay-Agar wurden hinzugefügt und Kolonien haben eine rote Farbe durch Reduktion der TTC Verbindung im Overlay-Agar entwickelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: der NIST integrierte Kolonie Enumerator (Nizza) Softwareschnittstelle. Grafische Darstellung der schönen Software-Oberfläche. Regionen von Interesse (ROIs) sind über Kolonien für jeden Fleck vor der Zählung zentriert. Die Daten können direkt aus dem schönen Fenster. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: LBA Platten gezählt in nette Software. Die Farbe Foto Bilder in schöne Software geladen und Kolonie bildende Einheiten (KBE) werden automatisch gezählt. Dieses Bild zeigt zwei repräsentative LBA-Platten mit ihren Angaben zur Anzahl der Kolonie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 185 167 145 151 122 134 119 142 124 115 113 123 1:17496 Verdünnung 8 186 152 145 138 132 135 108 116 100 119 105 109 1:5832 Verdünnung 7 179 160 145 135 109 120 54 55 71 75 79 89 1:1944 Verdünnung 6 193 153 146 138 87 105 5 6 6 9 19 30 1:648 Verdünnung 5 184 129 121 143 6 7 0 1 1 1 1 1 1:216 Verdünnung 4 180 145 22 24 2 3 3 1 1 0 0 0 1: 72 Verdünnung 3 207 129 1 0 2 2 1 0 4 1 0 1 01:24 Verdünnung 2 201 140 0 0 0 0 1 1 1 0 4 4 1:8 Verdünnung 1 Steuerung A Steuerung B Beispiel 1 Beispiel 2 Beispiel 3 Probe 4 Probe 5 Tabelle 2: Anzahl der Bakterienkolonien. KBE zählt sind aus die schöne Software, excel-Format exportiert. Diese Zählungen können arrangiert werden, in eine Tabelle, die zeigt, dass die bakterielle für alle doppelten Proben und Kontroll-Vertiefungen zählt. Steuerung A Steuerung B 148 128 131 120 118 1:17496 Verdünnung 8 189 147 142 134 112 110 107 1:5832 Verdünnung 7 NSK (1-fünfjährigen/CtrA): 22 % 140 115 55 73 84 1:1944 Verdünnung 6 50 % KI (fünfjährigen/2): 73 142 96 6 8 25 1:648 Verdünnung 5 132 7 1 1 1 1:216 Verdünnung 4 23 3 2 1 0 1: 72 Verdünnung 3 1 2 1 3 1 01:24 Verdünnung 2 0 0 1 1 4 1:8 Verdünnung 1 Beispiel 1 Beispiel 2 Beispiel 3 Probe 4 Probe 5 Tabelle 3: Berechnung der cutoff-Wert 50 % KI und doppelte Probe Mittelwerte. Der KI-cutoff-Wert von 50 % wurde berechnet, indem der Durchschnitt aller Kontrolle B Brunnen dividiert durch 2. Durchschnitte von Duplikaten wurden für jede Verdünnung von jeder Probe berechnet, die in doppelter Ausführung ausgeführt wurde. NSK-Wert wird auch berechnet. Abbildung 4: Schematische der linearen Interpolation. Die Anzahl der überlebenden Bakterien (y-Achse) bei jeder Verdünnung des Serums ist getestet (x-Achse) aufgetragen (schwarze Diamanten) und einzelne Punkte durch die dünne, gestrichelte schwarze Linie verbunden sind. Die soliden und gestrichelte horizontale Linien zeigen 0 % und 50 % bzw. zu töten. Die Serum-Verdünnungen (Verdünnung 5) und unten (Verdünnung 4) die 50 % Linie zu töten durch eine rote Linie verbunden sind, und bakterizide Titer (KI) wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. SBA-KI Beispiel 1 72 Beispiel 2 216 Beispiel 3 1994 Probe 4 1994 Probe 5 648 Tabelle 4: SBA Ergebnisse zeigt bakterizide Titer (KI). SBA KI Endwerte für jede Probe wurden ermittelt und angezeigt. Diese Werte werden anhand der durchschnittlichen KBE, der KI-cutoff-Wert von 50 % und die lineare Interpolation Formel berechnet.

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll zeigt einen funktionalen immun-Assay zur Beurteilung der Shigellacidal Aktivität der Antikörper im Serum. Studieren Sie in der Assay nachgewiesen für dieses Protokoll monoklonale Antikörper spezifisch für S. Flexneri 3a verwendeten9 zusammen mit Steuerung menschlichen Seren von einem vorherigen Shigella -Impfstoff wurden11. Die Quelle des Serums in diesem Assay getestet kann aus der präklinischen tierischen Proben zu menschlichen klinischen Proben unterschiedlich, und die Shigellacidal Aktivität der Serumprobe betroffen Impfungen und Forderungen, die das Individuum erlebt hat. Einige Kreuzreaktivität zwischen eng verwandten Serotypen, speziell S. Flexneri 2a und 3a S. Flexneri gerechnet werden, doch wenig Kreuzreaktivität ist in dieser Stämme im Vergleich zu S. Sonnei9gesehen worden. Die Basis des SBA konzentriert sich auf die Aktivierung der Komplementkaskade durch die Antikörper-Antigen-Bindung. Daher ist der Umgang mit den BRC-Reagenz eine der vielen kritischen Schritte bei der Durchführung dieses Protokolls. BRC wurde für den Einsatz in diesem Assay wegen seiner konstanten Leistung und niedrige Konzentrationen von NSK in anderen bakterizide Assays12,13,14ausgewählt.  Die Aktivität des BRC ist temperaturempfindlich und entsprechende Maßnahmen ergriffen werden, um sicherzustellen, dass das Einfrieren Auftauen Zyklen werden minimiert, dass die BRC regelmÄÑig in Einzelnutzung Bände, und BRC Aliquote schnell, unmittelbar vor der Verwendung in der Probe aufgetaut sind. Die Konsistenz der Komplementaktivität wird die Reproduzierbarkeit des Assays auswirken. Ein weiterer wichtiger Schritt, die Auswirkungen der Assay Reproduzierbarkeit ist die Herstellung und Verdünnung der bakteriellen Bestände. Es ist wichtig, dass vor Beginn des Tests wird die entsprechende Verdünnung der bakteriellen Aktien bestimmt, als Assay Erfolg abhängig von der konsequente Produktion von Kontrollen A und B mit KBE zählt ~ 120 KBE pro Spot im Durchschnitt ist. Um Pickel, die durch die Software zählbare sind, ist es auch zwingend notwendig, dass die Technik verwendet, um Platte Bakterien erfolgreich ausgeführt wird. Die Ablagerung bakterielle Lösung und Kippen der Platte, so dass Flecken ~ 2-3 laufen cm ist entscheidend für die Herstellung von Kolonien die richtige Größe und korrekte Verteilung für die genaue Zählung durch die schöne Software. All diese Schritte zu meistern wird sichergestellt, dass präzise, konsistente Ergebnisse durch dieses Protokoll hergestellt werden

Selbst wenn alle kritischen Schritte ausgeführt sind auch noch möglicherweise in einigen Fällen es nötig ist, zu ändern oder dieses Protokolls zu beheben. Änderungen dieses Protokolls auszuwertende andere Bakterien benötigen Optimierung von der Übernachtung LBA Platte Inkubationstemperatur, um die Bildung von Mikro-Kolonien zu gewährleisten. Andere Stämme von Bakterien oder Antikörper können Quellen als Serum, Optimierung der Ergänzung Konzentration erfordern. NSK Werte und KIs Kontrolle Sera sollten ebenfalls überwacht werden, um sicherzustellen, dass die Probe entsprechend funktioniert. NSK sollte nicht mehr als 70 % steigen. Die KI der Kontrolle, die Sera nicht variieren sollte bedeuten mehr als ± 2SD. Um erfolgreich und konsistente Ergebnisse zu erreichen, wenn Sie dieses Protokoll verwenden, werden muss alle Schritte, wie hier mit besonderem Augenmerk auf die oben genannten kritischen Schritte beschrieben.

Während dieses Protokoll eine wichtige Notwendigkeit in der Forschungsgemeinschaft Shigella füllt, ist es nicht ohne seine Grenzen. Dieses Protokoll setzt auf biologische Materialien und werden daher immer gewisse Variabilität, die schwer zu kontrollieren ist. Variationen in Komplementaktivität aus verschiedenen Chargen und Quellen können zur Variabilität in Tests beitragen. Um dies zu mindern, ist es wichtig, Ergänzung entsprechend behandeln und neue viele Ergänzung für Aktivität vor dem Kauf zu testen. Es kann auch hilfreich Pools Ergänzung lose mit bekannter Aktivität, eine homogene Versorgung haben zu erstellen sein. Dieses Protokoll ist standardmäßig einfach und erfordert spezielle Ausrüstung und die automatisierte Kolonie auflisten von Software ist frei verfügbar. Während diese Einfachheit ein Vorteil ist, erfordert so dass dieses Protokoll in praktisch jedem Labor verwendet werden es noch eine Inkubation über Nacht. Den letzten Tests wurden beschrieben, die haben viel kürzere Inkubationszeit Anforderung, aber erfordern spezialisierte, vorbereitende Reagenzien15. Eine weitere Einschränkung des Assays ist, dass in seiner jetzigen Form nur in der Lage, einen einzelnen Bakterienarten auf einmal zu untersuchen. Im Feld Shigella gibt es ein Wunsch, einen multivalente Impfstoff zu schaffen, und immunologischen Assays, die Krankheitserreger in einer Multiplex-Weise beurteilen können, ist von großem Wert. Dieser Test könnte in der Zukunft geändert werden, um diesem Bedarf zu entsprechen, aber in seiner jetzigen Form ist es ein Single-Plex-Assay.

Während dieser Assay einige Einschränkungen hat, hat es immer noch viele Vorteile gegenüber bestehenden oder alternative Methoden. Diese Vorteile umfassen viele Verbesserungen, die kombinieren, um die Ausführung dieser Methode viel weniger arbeitsintensiv und Hochdurchsatz als traditionelle SBAs machen. Die Verwendung von gefrorenen bakterielle Aktien, eine 96-Well-Platte-Assay-Format, die Beschichtung auf größere quadratische Petrischalen, die Färbung der Kolonien, die fotografieren und automatische Koloniezahlbestimmung, ermöglicht alle dazu beitragen, die Materialien und für benötigte Zeit dies zu reduzieren Assay. Dieser Test hat auch Vorteile gegenüber anderen Hochdurchsatz-Methoden, weil es keine spezielle Reagenzien oder Ausrüstung erfordert. Das Protokoll beschrieben kann mit grundlegenden Reagenzien und frei verfügbare Software, die für seine Anwendung in jedem Labor durchgeführt werden.

Alle Vorteile, die dieses Protokoll unterstützt seine Verwendung in vielen zukünftigen Untersuchungen. Der Test eignet sich für die Prüfung der Immunantwort nach Impfung oder natürliche Infektion. Diese Anwendung ermöglicht die SBA ein wertvolles Werkzeug in Shigella -Impfstoff-Forschung sein und bereits verwendet wurde, um Impfstoff Immunogenität in Shigella -Bio-Konjugat-Impfstoffen zu bewerten, wo es die Fähigkeit dieser Impfstoffe zu gezeigt hat die Herstellung von funktionalen Antikörper16zu induzieren. Dieses Protokoll wurde von mehreren Labors ausgiebig getestet und hat gezeigt, dass zuverlässige, reproduzierbare Ergebnisse9zu produzieren. Dieses Protokoll produziert auch vergleichbare Ergebnisse, wenn die gleichen Proben mit anderen bakterizide Assays17getestet werden. Die Konsistenz der Daten durch dieses Assay generiert, und seine Kompatibilität mit anderen älteren Methoden macht es ein robustes Werkzeug für präzise Beurteilung bakterizide Aktivität in Serumproben. Der Test kann auch leicht auszuwertende zusätzliche Probentypen angepasst werden. Während Serum in Erwachsenen klinischen Studien verfügbar ist, kann es schwierig, ausreichend Serum in Studien mit Schwerpunkt auf Säuglinge und Kleinkinder erhalten sein; einer der möglichen Zielgruppen für Shigella Impfstoffe. In diesen Studien ist Vollblut routinemäßig auf Filterpapier gesammelt und getrocknet. Einige erste Erfolge mit dieser Art von Beispiel-Format unter Verwendung der SBA stattgefunden hat. Neben Vollblut sind Schleimhaut Proben (z. B. fäkal-Extrakte Speichel und Urin) auch ein Ziel, das in Shigella -Impfstoff-Forschung von Bedeutung ist. Derzeit dieses Protokoll für drei der klinisch relevanten Serotypen von Shigella bewertet worden, aber es kann auch für zusätzliche Shigella spp., sowie andere bakterielle Erreger angepasst werden. Zukünftige Arbeit konzentriert sich auf die Produktion eines Multiplex-Assays mit vielen der gleichen Eigenschaften wie der Test von diesem Protokoll beschrieben. Eine Multiplex-Assay ermöglicht Bewertung von mehreren Shigella Serotypen gleichzeitig Probenvolumen und Hände Assay rechtzeitig weiter zu schonen. Es gibt auch Arbeit im Gange, um dieser Assay in Labors auf der ganzen Welt übertragen. Diese globale Auswertungen generieren mehr Daten zur Qualifikation des Tests in einem größeren Maßstab der Forschung, bei gleichzeitiger Erhöhung der Anzahl der Mikrobiologie und Immunologie Laboratorien, die Zugang zu diesem SBA, Bakterien und Serum zu bewerten haben Proben von verschiedenen endemischen Standorten gesammelt. Der hier beschriebene Test ist einfach und hohem Durchsatz und hat die Fähigkeit, immunologische Beurteilung in Shigella -Bereich, sowie breitere Anwendungen zur Beurteilung der anderen bakteriellen Krankheitserregern zu verbessern.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde finanziert durch ein Stipendium der Pfad zu M.H.N. Diese Studie wurde als Cooperative Research und Development Agreement zwischen dem Walter Reed Army Institute of Research und der University of Alabama in Birmingham.

Materials

Gelatin Sigma G9391 Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) Sigma T8877 ≥98.0% (HPLC)
Sodium azide (NaN3) Sigma S2002 ≥99.5%
Baby Rabbit Complement PelFreez 31061-3 3-4 week old
HBSS with Ca2+/Mg2+ Invitrogen 14065-56 Without Phenol Red
LB Agar (Lennox) Sigma L2897 Powder microbial growth medium
Bacto Agar BD 214010 Powdered, (C12H18O9)n
Glycerol Sigma G5516 For molecular biology, ≥99%
LB Broth (Lennox) Sigma L3022 Powder microbial growth medium
Square Petri Dish Sigma Z617679-240EA 120 mm x 120 mm
Assay Plate Costar 3799 96 well u-bottom plate with lid
NICE Software University of Alabama at Birmingham ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/
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References

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Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).
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