תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

פרוטוקול זה עוקב אחר הקווים המנחים של לוח הגנה WRAIR של הסובייקט האנושי. דגימות המשמשות במחקר זה הן דוגמאות בנסיוב אדם נאספו במסגרת מספר פרוטוקול WRAIR 1328, בהתאם לכל תקנות מוסדיים ו פדרלי המסדירים את ההגנה של בני אדם. הדגימות היו בטל מזוהה, השימוש של הדגימות אנונימי כשטח ניסויים אנושיות מאת IRB UAB (פרוטוקול מס ‘ N150115001). 1. מכינים Assay ריאגנטים להכין 1% ג’לטין על-ידי הוספת 1 גר’ ג’לטין 100 מ ל מים. אוטוקלב וחנות בטמפרטורת החדר. להכין 100 מ”ג/מ”ל TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium כלוריד) מניות פתרון (1, 000 x) על-ידי הוספת 5 גר’ TTC 40 מ ל מים. המכללה הוא נמס במלואו, לכוונן את עוצמת הקול כדי 50 מ עם מים, מסנן סטרילי באמצעות מסנן 0.2 µm. לאחסן את הפתרון ב 4 ° C, להגן מפני אור.הערה: TTC צובע את המושבות חיידקי והופכת אותם הרבה יותר קל לספור. פתרון TTC יש צבע צהוב קלה. אם הפתרון TTC מתפתח צבע אדום, למחוק, להכין טרי. הכינו 10% נתרן אזיד (נאן3) מניות הפתרון (100 x) על-ידי הוספת 5 g נאן3 40 מ ל מים. לאחר התפרקות מוחלטת, מוסיפים מים עד 50 מ”ל. לאחסן בטמפרטורת החדר.התראה: אזיד הנתרן רעל, עלולים להיות רעילים אם בלע או נספג דרך העור או העיניים. זה עשוי להגיב עם עופרת, צנרת נחושת כדי ליצור נפיץ ביותר azides מתכת. על השמטה של ריאגנטים המכיל אזיד הנתרן, לשטוף עם כמויות גדולות של מים כדי למנוע הצטברות אזיד או למחוק בשקית של חומרים מסוכנים. להכין צלחת LBA (צלחת אגר ליברות) על-ידי הוספת 35 גר’ אגר LB 1 ליטר של מים ושל אוטוקלב. להוסיף 25 מ ל כל צלחת פטרי מרובע (120 x 120 מ מ2). דגירה צלחות ב RT למשך 10-20 דקות כדי לאפשר אגר לגבש. המקום הצלחות בחזרה לתוך שקיות פלסטיק וחנות ב 4 ° C עד חודש. להכין כיסוי אגר על-ידי הוספת 7.5 גר’ של אגר 1,000 מ של מים, החיטוי. דגירה באמבט מים 56 ° C עד שהוא נדרש. לפני השימוש, להוסיף 1 מ”ל של 100 מ”ג/מ”ל TTC, 10 מ של 10% נאן3 ולערבב היטב.הערה: כל צלחת LBA צריך 25 מ של כיסוי אגר. כיסוי אגר תוכלו להיות מוכנים מראש חודש, מומסת במיקרוגל או על פלטה חמה לפי הצורך עבור וזמינותו. ודא כי הטמפרטורה אגר ~ 55 ° C לפני ליישום lba של צלחות. להכין מאגר Assay על-ידי הוספת 5 מ”ל מאוזן מלח פתרון (HBSS של הנקס x 10) עם Ca2 +/Mg2 + ו- 5 מ של ג’לטין 1% 40 מ ל מים. לאחסן בטמפרטורת החדר. 2. מכינים המשלים יעד חיידקים להכין ארנב התינוק המשלים (BRC)הערה: קריטריונים מפורטים עבור המשלים הרבה בחירה, ניתן למצוא כאן: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf והשתמש BRC קפואים להפשיר עם זורמים מים קרים. לערבב פיזית BRC כל ~ 10-20 דקות עד הקרת לחלוטין. כפופים BRC מחזורים הפשרת ההקפאה חוזרות ונשנות. בעוד BRC הוא מפשיר, תווית צינורות צנטריפוגה 1.5 mL, 5 מ ל או 15 מ”ל. המקום הנקרא צינורות על הקרח להתקרר מראש. אחסון נאות aliquot BRC כדי הצינורות צנטריפוגה טרום מקורר (לאחר מילוי, מיד לחזור כל שפופרת הקרח). חנות aliquots-≤-70 מעלות צלזיוס בתא ההקפאה.הערה: כ- 1 מ’ של המשלים נדרשת עבור כל צלחת וזמינותו. Aliquots המשלים לשימוש יחיד, צריך להיות aliquoted בכמויות המתאימות assay פריסות. כדי להכין BRC חום-לא פעיל, להפשיר aliquot אחד של פעיל BRC. הכנת אמבט מים 56 ° C. אחרי BRC מופשר הוא לחלוטין, להעביר אותו המים הרותחים, דגירה למשך 30 דקות. לאחר דגירה, להסיר BRC להשבית חום לאמבט מים ומאפשרים כדי להתקרר ב RT למשך 10-15 דקות לערבב נמרצות, ו aliquot µL ~ 150 ל 1.5 mL microcentrifuge צינורות. חנות aliquots-≤-10 ° C. הכן מטרה מלאי חיידקיםהערה: ההליך שלהלן משמשת להכנת aliquots 48 של מניות חיידקים היעד; אם aliquots יותר יש צורך בפרוטוקול וניתן לשנותם. להסיר את החיידקים המניות הראשי בקבוקון מהמקפיא, לגרד את פני השטח חיידקי קפוא כדי להסיר כמות קטנה של קרח הצנצנת על צלחת אגר דם. להחזיר לאלתר את המבחנה מניות מאסטר למקפיא. פסים זה aliquot קטן של מניות חיידקי צלחת אגר דם ועל כיסוי עם המכסה את הצלחת. דגירה את הצלחת הפוך בין לילה ב- 37 °C/5% CO2 מגשים. העברת המושבות חלקה מבודד ~ 10 שפופרת 50 מ ל המכיל 30 מ ל מרק ליברות. תקופת דגירה של 3-5 h ב 37 ° C עם טלטול עדין עד שהמרק תרבות יש את יתר של600 של ~0.6-0.7. למסוק העליון מ”ל של תרבות ושל העברת צינור מ”ל. Centrifuge התרבות ב x 15,000 g למשך 2 דקות באמצעות מיקרו-צנטריפוגה מלמעלה בטבלה. למחוק את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את צניפה ב 25 מ של 15% סטרילי גליצרול-LB. מערבבים היטב, לוותר על 0.5 mL aliquots לתוך צינורות סטרילי mL 1.5 מיקרו צנטריפוגה (~ 48 צינורות). חנות aliquots-≤-70 מעלות צלזיוס במקפיא. לאשר את זהותה חיידקי באמצעות מבחן התלכדות לפני השימוש. הנחישות של האופטימלית דילול גורם עבור מניה חיידקים היעדהערה: כל אצווה של מניות חיידקים היעד, חייב להיות טיטרציה בתנאים assay כדי לקבוע צורך תשואות ~ 120 CFU/מקום על לוחות LB הדילול. מספר רישוי microtiter (דילול צלחת) ולהוסיף 135 µL Assay מאגר טוב 1A. להוסיף 120 µL Assay חמאה כדי בארות 1B – 1H. הסר בקבוקון של חיידקים היעד קפוא מהמקפיא, להפשיר בטמפרטורת החדר. להוסיף 15ul של מניות חיידקי המופשרים טוב 1A כדי לגרום לדילול המניות חיידקי 10-fold. להעביר 30 µL של חיידקי פתרון טוב 1A 1B טוב לבצע לדילול טורי 5-fold. המשך 5-fold טורי דילולים טוב 1H סה”כ 8 דילולים (1:10 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250). להביא microtiter עוד צלחת (צלחת Assay) ולהוסיף 20 µL Assay המאגר כדי טוב בעמודות 1 ו- 2 בצלחת וזמינותו. להעביר 10 µL של חיידקים מדולל מכל קידוח בעמודה 1 של צלחת דילול הבארות המתאימים בעמודות 1 ו- 2 של צלחת וזמינותו. 10 µL של חיידקים יועברו מ 1A טוב של צלחת דילול לתוך טוב 1A ו- 2A Assay צלחת, וכו ‘. המשך וזמינותו כמתואר בסרום אחרים Assay (SBA) מתחת עבור שליטה A ו- B שליטה, צעדים 3.6-3.12. לאחר הצלחות יש כבר מתפשט על קרח, להשתמש על פיפטה רב-ערוצי עם 8 טיפים פיפטה לזהות µL 10 מן הבארות בעמודה 1 על גבי צלחת LBA. כמו כן, במקום הבארות מעמודה 2 לצלחת LBA. המשך וזמינותו כמפורט להלן צעדים 3.14-4.6. לקבוע דילול חיידקים המניבה ~ 120 ש-CFU/במקום שליטה B, דילול זה ישמש וזמינותו. 3. סרום Assay אחרים (SBA) הערה: ההליך המתואר להלן לוח assay אחד, אך ניתן להגדיל את מספר הצלחות וזמינותו. בטל-חום לבחון דגימות על ידי דגימות ומוכנסות באמבט מים 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.הערה: הבדיקה דוגמאות חייב להיות חום-לא פעיל לפני הבדיקה כדי ביטל כל פעילות משלים אנדוגני. זה יכול להיעשות לפני וזמינותו, יכול להיות מחדש קפוא או המאוחסנים ב 4 ° C עד נבדקו דוגמאות מוחלש. מקבל צלחת Assay להוסיף 20 µL Assay מאגר עמודות 1 עד 12 מתוך שורות A באמצעות G. להוסיף 20 µL Assay מאגר עמודים 1 ו- 2 בשורה H, ראו טבלה 1. לטעון µL 30 של כל מבחן מדגם, כפולות, לשורה H של צלחת וזמינותו. כך למשל, לוותר על 30 µL מדגם 1 לתוך בארות 3 H ו- 4 H, לוותר על 30 µL מדגם 2 לתוך בארות 5 H ו- 6 H, וכו ‘. ביצוע דילולים טורי 3-fold של הבדיקה דוגמאות באמצעות פיפטה רב-ערוצי. להסיר 10 ממוצע המדגם מבארות 3H – 12H והעברת ולס המתאימות בשורה G ומערבבים את הדגימה היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 8 – 10 פעמים. ואז להסיר 10 ממוצע מבארות דור 3-12G ואת העברת ולס המתאימות בשורה F ומערבבים היטב. המשך אלה דילולים טורי דרך שורה א לאחר ערבוב הבארות בשורה A, להסיר ולמחוק µl 10 מ בארות 3A-12A כך כל בארות להכיל 20 µl.הערה: מכיוון µL 20 של נסיוב משמש אמצעי assay סך של 80 µL, יש 4-fold לדילול נוסף ב וזמינותו. דילול זה חייב להילקח בחשבון במהלך חישוב כייל SBA על-ידי הכפלת הדילול של סרום 4. לדוגמה, אם משמש לדילול ההתחלתי של 1:2, דילול בפועל הנבדקת היא 1:8. הסר את בקבוקון אחד של קפואים מלאי חיידקים היעד, להפשיר בטמפרטורת החדר. לדלל את החיידקים ב- 20 מ של מאגר Assay לפי הגורם דילול האופטימלי שנקבע מראש (הגורם לדילול זה נקבע ב סעיף 2.3). להוסיף 10 µL של חיידקים מדולל מכל קידוח של צלחת assay באמצעות פיפטה רב-ערוצי. הסר בקבוקון אחד של BRC קפוא, בקבוקון אחד של קפוא לא פעיל חום BRC, להפשיר בטמפרטורת החדר עם זורמים מים קרים או במקום על הפתח של בטיחות ביולוגית ארון עם משבי אוויר להפשיר במהירות. להכין פתרון 20% של חום-לא פעיל BRC. מיקס 100 µL של חום-לא פעיל BRC עם 400 µL Assay המאגר. להוסיף 50 µL של פתרון BRC להשבית חום זה 20% כל בארות בעמודה 1 (פקד וולס).הערה: BRC להשבית חום משמש פקד לעקוב אחר הרג לא ספציפית (NSK) ב וזמינותו. להכין פתרון 20% של יליד BRC. מערבבים 1 מ”ל של BRC מקורית עם 4 מ של מאגר וזמינותו. להוסיף 50 µL של תערובת זו כל בארות בעמודות 2 עד 12 (בארות שליטה B ומבחן לדוגמה).הערה: הריכוז הסופי של BRC בתערובת התגובה הוא 12.5%. בקצרה לערבב Assay צלחת ע י ניעור בעדינות במשך 10-15 s במטרף צלחת או לערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה 8 פעמים באמצעות פיפטה רב-ערוצי. לשים את הצלחת Assay חממה מיקרוביולוגית 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים (בלי ללחוץ). יבש שתי צלחות LBA על-ידי הסרת המכסים והצבת לוחות פנים למעלה בבטיחות ביולוגית בארון למשך 40-60 דקות. עם השלמת הדגירה 2 h, להעביר את הצלחת Assay רטוב קרח, תקופת דגירה של 10-20 דקות לעצור את התגובה. באמצעות פיפטה של 12 ערוצים, מערבבים הבארות בשורה H, וכך ספוט צלחת 10 µL של תערובת התגובה על גבי תחתית צלחת LBA. מיד להטות את הצלחת ולאפשר המקומות ינסה לברוח ~1.5-2 ס מ. חזור על הליך זה עבור שורה G, F ו- E, לאתר אותם מעל השורה הקודמת על הצלחת LBA. שורה E, F, G ו- H הם הבחינו אל אחד lba של צלחת, ואת השורה A, B, C ו- D הם הבחינו לצלחת LBA השני באותו אופן, ראה איור 1. דגירה הלוחות LBA בטמפרטורת החדר עד הספוחה הוא הפתרון לתוך הצלחות LBA (10-15 דקות). לשים את המכסים על לוחות LBA ולמקם את הצלחות ב- lba של חממה מיקרוביולוגית במהופך על דגירה בין לילה (~ 16-18 h). דגירה ס flexneri 2a ו- 3a ב 29 ° C, דגירה sonnei ס היא 26 מעלות צלזיוס.הערה: טמפרטורות אלו תשואות קטן “מיקרו-קולוניות” עם גדלים מתאים עבור ספירה מדויקת על ידי המושבה מונה9. לאחר דגירה לילה, להוסיף 25 מ של כיסוי אגר (ב ~ 55 מעלות צלזיוס) המכילה 100 µg/mL TTC, נאן 0.1%3 כל צלחת LBA. דגירה הלוחות LBA ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לאפשר את החיידקים ששרדו לפתח צבע אדום, ראה איור 1 שלהלן. צילום צלחות באמצעות מצלמה דיגיטלית, העברת תמונות למחשב שבו הותקנה תוכנה Enumerating המושבה משולב של NIST (NICE), ראה איור 2.הערה: תוכנה נחמדה ספירת המושבה הינה זמינה ללא תשלום. לקבלת פרטים והוראות התקנה, ראה רשימת חומרים . 4. ספירת מושבות בקטריאלי תוכנת נחמד פתוח, קלט שם המפעיל, ניסוי מידע, וכל assay פתקים לתוך השדות הריקים. לאחר הזנת הנתונים הזה לחץ על הלחצן עשו . לייבא לוחות המצולם על-ידי לחיצה על לחצן פתח ובחירה שהקבצים הנכונים מהמחשב. כוונן את הפרמטרים assay על-ידי הגדרת מספר השורות 4 ואת מספר העמודות עד 12. להתאים את הגדרת הרקע -3 סיגמא ברזולוציה נמוכה. ראה איור 2. להעביר את האזורים של הריבית (ROIs) על ידי לחיצה וגרירה כך כל רועי ישירות על דוגמא אחת נקודה. להבטיח כי כל מושבות חיידקים בתוך רועי עם אין חפיפה בין הדגימות. לאחר סיום צלחת אחת, לחיצה כפולה לצלחת הבא ברשימה תמונות נתונים מאוחסנות ולהתאים את ROIs. ראה איור 2. כאשר כל הצלחות הותאמו, לחץ על הכפתור הירוק של הרוזן , ראה איור 2 ואיור 3. ספירת תסתיים לחץ על הלחצן ‘ ייצוא ‘ כדי לייצא את הנתונים בתבנית.xls/.xlsx. שם ולשמור את הקובץ.xls/.xlsx לניתוח נתונים. לארגן נתונים שיוצאו לתוך תבנית טבלה כך ספירות מסודרות ב טבלה המייצגת את הצלחת assay 96-ובכן, נראה בטבלה 2. 5. חישוב SBA כייל נוגדנים (KI) והרג שאינם ספציפיים (NSK) הערה: SBA כייל נוגדנים, או הריגתו אינדקס (KI) מוגדרת על הדדיים של דילול סרום שהורג 50% של חיידקים היעד. לחשב את 50% להרוג ערך סף האינדקס (KI) על ידי חישוב ממוצע של CFU של המשלים פעיל שליטה בארות (שליטה ב) ואת חלוקת ב- 2. לחשב את CFU הממוצע עבור כל דילול של כל מדגם זה היה להפעיל שכפול, עיין בטבלה 3. מכיוון לדילול סרום תניב לעתים נדירות בדיוק ערך קי זה 50%, זה יכול להיות אינטרפולציה של שני רציפים סרום דילולים, אחד שהורג פחות מ 50%, אחד שהורג למעלה מ-50%, ראה איור 4. הנוסחה לחישוב הקי SBA עם אינטרפולציה מוצג להלן:הערה: כייל נוגדנים אחרים, או קי, גם ניתן לחשב באופן אוטומטי באמצעות התוכנה Opsotiter שפותחה על ידי UAB. כדי לבקש Opsotiter, פנה ד ר מון Nahm או מר רוב ברטון. ראה https://www.vaccine.uab.edu לקבלת מידע ליצירת קשר. לחשב את הערך NSK בלקיחת 1 מינוס הממוצע של B שליטה מחולק הממוצע של שליטה א