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Immunology and Infection

Un haut débit de Shigella-test bactéricide spécifique

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59164
, , ,
1Department of Enteric Infections, Bacterial Diseases Branch,Walter Reed Army Institute of Research, 2University of Alabama at Birmingham

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à mesurer l’activité Shigellacidal des anticorps dans le sérum. Sérum est mélangé avec des bactéries et complément exogène, incubé, et le mélange réactionnel est plaqué sur milieu gélosé. Bactéries viables forment des colonies qui comptent, à l’aide d’un énumérateur de colonie automatisés et utilisé pour déterminer le titre bactéricide.

Abstract

Dosages bactéricides sériques (SBAs) mesurent l’activité fonctionnelle des anticorps et ont été utilisés pendant de nombreuses décennies. ZSB mesure directement l’activité de mise à mort des anticorps en évaluant la capacité des anticorps dans le sérum et se lient aux bactéries et activer le complément. Cette activation du complément entraîne la lyse et l’abattage des bactéries cibles. Ces tests sont précieuses car elles vont au-delà de la quantification de la production d’anticorps pour élucider les fonctions biologiques qui ont ces anticorps, ce qui permet aux chercheurs d’étudier le rôle que les anticorps peuvent jouer dans la prévention de l’infection. ZSB ont été utilisés pour étudier les réponses immunitaires de nombreux agents pathogènes humains, mais il n’y a aucune méthodologie largement acceptée pour Shigella à l’heure actuelle. SBAs ont toujours été très fastidieux, nécessitant de nombreuses étapes fastidieuses pour quantifier avec précision les bactéries survivantes. Ce protocole décrit un simple, robuste, et haut débit test que mesures anticorps fonctionnels spécifiques à Shigella dans le sérum in vitro. La méthode décrite ici offre beaucoup d’avantages sur SBAs traditionnels, y compris l’utilisation des stocks bactériennes figés, 96 bien doser assiettes, un système de micro-culture et colonie-comptage automatisé. Toutes ces modifications rendent ce dosage moins fastidieuse et plus haut-débit. Ce protocole est plus simple et plus rapide à effectuer que SBAs traditionnelles tout en utilisant des technologies simples et réactifs facilement disponibles. Le protocole a été appliqué avec succès dans plusieurs laboratoires indépendants et le test est fiable et reproductible. Le test peut être utilisé pour évaluer les réponses immunitaires dans les études précliniques et cliniques. En quantifiant les titres d’anticorps shigellacidal avant et après l’exposition de l’antigène (que ce soit par l’infection ou la vaccination) permet une meilleure compréhension des anticorps fonctionnels comment les réponses sont générées et leur contribution à l’immunité protectrice. Le développement de cette normalisés, dosage bien caractérisé peut grandement faciliter la conception de vaccins Shigella .

Introduction

Sérotypes de Shigella , Shigella flexneri 2 a, 3 a S. flexneri et S. sonnei, démontrent la prévalence épidémiologique dans le monde. Les maladies diarrhéiques causées par ces Shigella espèces répercussions militaires, les voyageurs1et est des principales causes de décès diarrhéiques chez les enfants âgés de moins de 5 dans les pays en développement2. Il n’existe actuellement aucun vaccin autorisé pour protéger contre la shigellose, cependant, il y a plusieurs vaccins candidats à différentes étapes du développement. Beaucoup de ces vaccins et d’autres mesures prophylactiques en cours de développement, se concentrer sur les anticorps produits contre Shigella lipopolysaccharide (LPS). LPS est un candidat-vaccin attrayant parce que c’est un antigène de surface du majeur et l’infection naturelle par Shigella induit des anticorps LPS spécifiques qui peuvent être protectrice contre une réinfection dans une manière spécifique de sérotype. Par conséquent, un vaccin efficace de Shigella devra probablement être multi-valent et cible 3-4 que sérotypes de Shigella pour induire une immunité contre 70-80 % des souches3,4, en circulation dans le monde 5 , 6. pour cela, que des épreuves pour évaluer les candidats vaccins anti- Shigella est spécifique de plusieurs sérotypes différents.

Les tests immunologiques actuellement pour l’évaluation des vaccins candidats se concentrent sur la quantification des niveaux des titres d’anticorps, mais il y a quelques essais bien caractérisés pour évaluer des anticorps fonctionnels. L’examen de la capacité fonctionnelle d’anticorps est important parce que les anticorps spécifiques pathogènes sont responsables de la lutte contre l’infection par un certain nombre de mécanismes fonctionnels incluant contraignant les antigènes de surface de bactéries et empêche l’adhérence à et infection des cellules épithéliales, ciblant les cellules bactériennes ou d’opsonisation et de phagocytose et directement tuer les agents pathogènes en liant et en initiant la cascade du complément. La mise à mort directe des bactéries par les anticorps se produit lorsque les anticorps se lient aux composantes de la surface de la bactérie cible et lancer la cascade du complément conduisant à l’activation de nombreux zymogènes que finalement le résultat dans la formation de pores dans les bactéries cellulaire qui provoque la mort de lyse et bactériens. Cette mise à mort directe de bactéries en faisant circuler des anticorps et le complément peut être une ligne début cruciale de défense au cours de l’infection.

Les personnes qui sont naturellement infectés ont des anticorps ayant une activité shigellacidal dans leurs sérums. Ces anticorps spécifiques de Shigella-ont été détectés à l’aide traditionnelle meurtre médiée par le complément des analyses de 7,8. Cela indique qu’il peut y avoir un rôle pour des anticorps bactéricides en matière de protection contre la shigellose. Dosages bactéricides traditionnels sont simples dans leur exécution : sérum est inactivés par la chaleur (pour détruire l’activité endogène de complément) et mélangé avec les bactéries d’intérêt. Complément exogène est ajouté à ce mélange à une concentration spécifique. Le mélange réactionnel est incubé pour permettre une mise à mort bactérienne et puis plaqué pour confirmer d’unités formant colonie (UFC). Une fois qu’UFC est comptés, on peut calculer un indice de la mort de 50 % (KI) et un titre de SBA déterminé. Tandis que cette procédure est relativement simple, ces tests peuvent être fastidieuses et chronophages à effectuer et les résultats peuvent être très variables. En plus de ces limites, sans essais fonctionnels bien caractérisées existent actuellement pour Shigella. Par conséquent, nous avons développé avec succès et qualifié un dosage simple et à haut débit pour mesurer l’activité bactéricide de Shigella pour trois des souches plus cliniquement pertinente9. Ce protocole décrit un SBA sous réserve de modifications qui améliorent l’efficacité du test et la reproductibilité. La première de ces modifications est l’utilisation des stocks bactériennes figés. La production des stocks réutilisables évite de bactéries fraîches de culture pour chaque dosage tout en réduisant la variabilité de test-de-test. Un autre temps et le travail enregistrement d’avantage de ce protocole est l’utilisation d’un format d’essai de plaque à 96 puits. Cela permet pour les dilutions d’échantillons ainsi qu’une gamme de concentrations peut être testée.  Il permet également l’utilisation des pipettes multicanaux pour placage des échantillons sur des plats de pétri carrée. Lorsque ces boîtes de pétri carrée sont utilisés en conjonction avec un système de culture qui produit des micro-colonies, le nombre de boîtes de gélose requis pour le dosage est réduit. Ceci, en combination avec disponible gratuitement logiciel de comptage de colonies, développé à l’origine pour le pneumocoque opsonophagocytic multiplexé tuant10de dosage (MOPA), permet l’énumération de colonie automatisée, rapide et fiable. Toutes ces améliorations réduisent considérablement les temps de dosage pratique et de créer un système de haut-débit permettant plusieurs plaques à exécuter à la fois.

Alors que ce protocole a été optimisé pour trois sérotypes plus cliniquement pertinente du Shigella, le SBA décrite ici peut être facilement appliqué aux nombreux autres pathogènes bactériens. En plus de l’utilisation potentielle de ce protocole avec d’autres bactéries, ce protocole a le potentiel d’étendre au-delà en utilisant seulement le sérum comme produit de départ, qui pourrait inclure l’analyse des anticorps dans d’autres types d’échantillon pertinentes telles que des échantillons de muqueuses, y compris la salive et les selles. L’utilisation de ce test pour étudier les réponses immunologiques après la vaccination peut donner plus large aperçu de la réponse immunitaire grâce à la vaccination, conduisant à la conception rationnelle des vaccins, et aide dans la compréhension de l’immunité naturelle comment se développe.

Protocol

Ce protocole suit les directives de la Commission de Protection du sujet humain WRAIR. Les échantillons utilisés dans cette étude sont des échantillons de sérum humain recueillies dans le cadre du numéro de protocole WRAIR 1328, les règlements institutionnels et fédéraux régissant la protection des sujets humains. Des échantillons ont été dépersonnalisées et l’utilisation de ces échantillons anonymes a été classifiée comme recherche de sujet non humain par l’IRB UAB (numéro de protocole N150115001). 1. préparer des réactifs de dosage Préparer 1 % gélatine en ajoutant 1 g de gélatine dans 100 mL d’eau. Stériliser et conserver à température ambiante. Préparer 100 mg/mL solution TTC (chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium) (1, 000 x) en ajoutant 5 g de TTC à 40 mL d’eau. Lorsque le TTC est entièrement dissous, réglez le volume à 50 mL avec de l’eau et filtre stérile à l’aide de 0,2 µm filtre. Conserver la solution à 4 ° C et protéger de la lumière.Remarque : TTC colore les colonies bactériennes et les rend beaucoup plus facile de compter. Solution de TTC a une légère couleur jaune. Si la solution TTC développe une couleur rouge, jeter et préparer fraîches. Préparer 10 % sodium azide (NaN3) solution (x 100) en ajoutant 5 g NaN3 à 40 mL d’eau. Après dissolution complète, ajouter de l’eau à 50 mL. Conserver à température ambiante.Mise en garde : L’azoture de sodium est un poison et peut être toxique si ingéré ou absorbé par la peau ou les yeux. Il peut réagir avec la tuyauterie en plomb et en cuivre pour former des azotures métalliques hautement explosifs. Lors de l’élimination des réactifs contenant de l’azide de sodium, couler avec un grand volume d’eau pour éviter l’accumulation d’azoture ou jeter dans un sac de biohazard. Préparer la plaque (plaque de gélose LB) de LBA en ajoutant 35 g d’agar LB à 1 L d’eau et stériliser. Ajouter 25 mL dans chaque boîte de pétri carré (120 x 120 mm2). Incuber les plaques à RT pendant 10-20 min pour permettre l’agar à se solidifier. Placer les plaques dans des sacs en plastique et conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois. Préparer la gélose Overlay en ajoutant 7,5 g d’agar à 1 000 mL d’eau et stériliser. Incuber dans bain d’eau de 56 ° C jusqu’à ce que nécessaire. Juste avant utilisation, ajouter 1 mL de 100 mg/mL TTC et 10 mL de 10 % NaN3 et bien mélanger.Remarque : Chaque plaque LBA a besoin de 25 millilitres de gélose de recouvrement. Gélose de recouvrement peut être établie vers le haut pour un mois à l’avance et fondue dans un four à micro-ondes ou sur une plaque chauffante au besoin pour le dosage. Assurez-vous que la température d’agar est ~ 55 ° C avant application aux plaques de la LBA. Préparation du tampon en ajoutant 5 mL de 10 x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) avec Ca2 +/Mg2 + et 5 mL de 1 % de gélatine à 40 mL d’eau. Conserver à température ambiante. 2. préparer le complément et cibler les bactéries Préparer le lapin bébé complément (BRC)Remarque : Détaillée des critères pour complément beaucoup sélection peut être trouvée ici : https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf Obtenir le BRC congelé et déglacez avec l’eau froide. Physiquement mélanger le BRC chaque ~ 10-20 min jusqu’à ce que complètement décongelée. N’exposez pas le BRC à répétés de gel-dégel. Alors que BRC décongèle, étiquette 1,5 mL, 15 mL ou 5mL tubes à centrifuger. Place étiqueté tubes sur la glace pour refroidir préalablement. Un volume suffisant aliquot BRC pour les tubes à centrifuger refroidis (après le remplissage, immédiatement retourner chaque tube sur la glace). Stocker les aliquotes à ≤-70 ° C dans le congélateur.Remarque : Environ 1 m du complément est nécessaire pour chaque plaque de test. Aliquotes de complément sont réutilisables et doivent être aliquotés en volumes appropriés doser les mises en page. Pour préparer le BRC inactivés par la chaleur, décongeler une aliquote de BRC active. Préparez un bain d’eau de 56 ° C. Après que BRC est complètement décongelée, transférer à l’eau du bain et incuber pendant 30 minutes. Après l’incubation, retirer le BRC inactivés par la chaleur du bain-marie et laisser pour refroidir à la droite pendant 10-15 min. mélanger vigoureusement et aliquote ~ 150 µL à tubes de microcentrifuge de 1,5 mL. Stocker les aliquotes à ≤-10 ° C. Préparation cible stock de bactériesRemarque : La procédure suivante est utilisée pour préparer des 48 parties aliquotes de stock de bactéries cibles ; Si plusieurs parties aliquotes sont nécessaires le protocole peut être entartré. Enlever les bactéries stock maître cuvette du congélateur et gratter la surface bactérienne gelée pour prélever une petite quantité de glace dans le flacon sur une gélose au sang. Retourner immédiatement le maître flacon de stock dans le congélateur. -Ensemencer cette petite aliquote de stock bactérienne sur la gélose au sang et le couvrir avec le couvercle de la plaque. Incuber la plaque à l’envers du jour au lendemain dans 37 °C/5% CO2 incubateur. Transférer environ 10 colonies lisses isolées dans un tube de 50 mL contenant 30 mL de bouillon LB. Incuber pendant 3-5 h à 37 ° C sous agitation douce jusqu’à ce que le bouillon de culture a une OD600 ~0.6 et 0,7. Récolter le haut 12,5 mL de la culture et le transfert à un tube frais 50 mL. Centrifuger la culture à 15 000 x g pendant 2 min à l’aide d’une micro-centrifugeuse de dessus de table. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 25 mL de 15 % de glycérol stérile-LB. Bien mélanger et répartir les aliquotes de 0,5 mL dans des tubes à centrifuger micro stérile de 1,5 mL (~ 48 tubes). Stocker les aliquotes à ≤-70 ° C dans le congélateur. Confirmer l’identité de bactéries utilisant le test d’agglutination avant utilisation. Détermination du facteur de dilution optimale pour stock de bactéries ciblesRemarque : Chaque lot de stock de bactéries cibles doit être titré dans des conditions de test pour déterminer la dilution nécessaire de céder ~ 120 CFU/tache sur plaques LB. Obtenez une microplaque (plaque de Dilution) et ajouter 135 µL de tampon de bien 1 a. Ajouter 120 µL de beurre de dosage au puits 1 b – 1H. Retirer un flacon de bactéries cibles congelées du congélateur et décongeler à température ambiante. Ajouter 15ul décongelés stock bactérienne bien 1 a pour faire une dilution de 10 fois de l’action bactérienne. Transférer 30 µL de solution bactérienne de puits 1 a bien 1 b pour effectuer une dilution en série 5 fois. Continuer 5 fois des dilutions successives bien 1H pour un total de 8 dilutions (01:10 01:50 1/250, 1:1 250 ; 1:6 250, 1:31 250 ; 1:156 250 ; 1:781 250). Obtenez une autre plaque de microtitration (essai de plaque) et ajouter 20 µL de tampon à tous bien dans les colonnes 1 et 2 dans la plaque de test. Transférer 10 µL de bactéries dilués de chaque puits dans la colonne 1 de la plaque de Dilution dans les puits correspondantes dans les colonnes 1 et 2 de la plaque de test. 10 µL de bactéries est transféré du puits 1 a de la plaque de dilution dans le puits 1 a et 2 a dans la plaque de test, etc.. Poursuivre le dosage comme décrit dans sérum bactéricide Assay (SBA) ci-dessous pour la commande A et B contrôle, mesures 3.6-3.12. Après que les plaques ont été incubés sur la glace, utilisez une pipette multicanaux avec 8 pointes de pipette à repérer 10 µL des puits dans la colonne 1 sur un plat de LBA. En outre, repérer les puits de colonne 2 sur la plaque de la LBA. Poursuivre le dosage comme décrit ci-dessous aux points 3.14-4.6. Déterminer la dilution de bactéries qui donne ~ 120 que CFU/spot contrôle b, cette dilution sera utilisé dans le test. 3. sérum test bactéricide (SBA) Remarque : La procédure décrite ci-dessous est pour une plaque d’essai, mais le nombre de plaques de dosage peut être augmenté. Chaleur-inactiver échantillons échantillons en incubation dans un bain d’eau de 56 ° C pendant 30 min.Remarque : Les échantillons doivent être inactivés par la chaleur avant l’essai d’abroger toute activité endogène de complément. Cela peut être fait avant le test et échantillons inactivés peuvent être congelés de nouveau ou stockés à 4 ° C jusqu’à ce que testé. Obtenir une plaque de test et ajouter 20 µL de tampon aux colonnes 1 à 12 de lignes A à travers G. ajouter 20 µL de tampon aux colonnes 1 et 2 de la ligne H, voir le tableau 1. 30 µL de chaque échantillon d’essai en double exemplaire, à la ligne H de la plaque de test de charge. Par exemple, diluer 30 µL de l’échantillon 1 dans des puits de 3 H et 4 H et distribuer 30 µL de l’échantillon 2 dans puits 5 H et 6 H, etc.. Effectuer 3 fois des dilutions d’échantillons à l’aide d’une pipette multicanaux. Enlever 10 µ de l’échantillon de puits 3H – 12H et le transfert aux puits correspondants en ligne G et mélanger l’échantillon bien par pipetage de haut en bas 8 – 10 fois. Puis retirez 10 µ de puits 3 et 12G et le transfert aux puits correspondants en ligne F et bien mélanger. Continuer ces dilutions en série par l’intermédiaire de ligne A. Après avoir mélangé les puits à la ligne A, retirez et jetez 10 µl de puits 3 a-12 a, afin que tous les puits contiennent 20 µl.Remarque : Parce que 20 µL de sérum est utilisé dans un volume de dosage total de 80 µL, il y a une dilution supplémentaire 4 fois dans le test. Cette dilution doit être tenue compte lors du calcul d’un titre de SBA en multipliant la dilution du sérum par 4. Par exemple, si une départ de dilution de 1:2 est utilisée, la dilution réelle testée est 1:8. Retirer un flacon de Stock de bactéries congelées visé et décongélation à température ambiante. Diluer les bactéries dans 20 mL de tampon selon le facteur de dilution optimale prédéterminée (ce facteur de dilution est déterminé à la section 2.3). Ajouter 10 µL de bactéries dilués dans chaque puits de la plaque d’essai à l’aide d’une pipette multicanaux. Retirer un flacon de BRC congelé et un flacon de gelée BRC inactivés par la chaleur, décongélation à température ambiante avec l’eau froide ou placer sur la grille d’une biosécurité armoire avec soufflant de l’air pour décongeler rapidement. Préparer une solution à 20 % de BRC inactivés par la chaleur. Mélanger 100 µL de BRC inactivés par la chaleur avec 400 µL de tampon. Ajouter 50 µL de cette solution BRC 20 % inactivés par la chaleur dans tous les puits dans la colonne 1 (commande A puits).Remarque : BRC inactivés par la chaleur est utilisé comme un contrôle pour surveiller le meurtre non spécifiques (NSK) lors de l’essai. Préparer une solution à 20 % de la CCFC native. Mélanger 1 mL de BRC native avec 4 mL de tampon. Ajouter 50 µL de ce mélange dans tous les puits dans les colonnes 2 à 12 (puits d’échantillon B contrôle et test).Remarque : La concentration finale de BRC dans le mélange réactionnel est de 12,5 %. Brièvement mélangez dosage plaque en agitant doucement pendant 10-15 s sur un agitateur de plaque ou de la composition de pipetage et descendre 8 fois à l’aide d’une pipette multicanaux. Mettre la plaque de test en incubateur microbiologique de 37 ° C pendant 2 h (sans agiter). 2 plaques sèches de LBA en retirant les couvercles et placer les plaques face au poste de sécurité biologique pour 40-60 min. Lorsque le 2 h d’incubation est terminée, déplacez le plateau de dosage mouillée de glace et incuber pendant 10-20 min arrêter la réaction. À l’aide d’une pipette de 12 canaux, mélanger les puits ligne H, et le spot plaque 10 µL du mélange réactionnel sur le fond d’une plaque de la LBA. Immédiatement basculer la plaque et laisser les taches à exécuter pendant ~1.5-2 cm. Répétez cette procédure pour ligne G, F et E, les taches au-dessus de la rangée précédente sur la plaque de la LBA. Ligne E, F, G et H sont repérées sur une plaque de LBA et ligne A, B, C et D sont repérées sur une seconde plaque LBA de la même manière, voir la Figure 1. Incuber les plaques LBA à température ambiante jusqu’à ce que la solution est absorbée dans les plaques LBA (10-15 min). Mettre les couvercles sur les plaques LBA et placer les plaques LBA dans l’incubateur microbiologique à l’envers à incuber pendant la nuit (~ 16-18 h). Incuber les S. flexneri 2 a et 3 a à 29 ° C et incuber S. sonnei est à 26 ° C.Remarque : Ces températures donnent des colonies plus petites « micro- » avec tailles appropriées pour le comptage précis en une colonie compteur9. Après une nuit d’incubation, ajouter 25 mL de gélose de recouvrement (à ~ 55 ° C) contenant 100 µg/mL TTC et 0,1 % NaN3 sur chaque plaque de LBA. Le LBA incuber à 37 ° C pendant 2 h permettre aux bactéries survivants de développer la couleur rouge, voir Figure 1 ci-dessous. Photographier les plaques à l’aide d’un appareil photo numérique et transférer des images vers un ordinateur où le logiciel d’énumération à la colonie intégré du NIST (NICE) a été installé, voir la Figure 2.Remarque : Logiciel de comptage de colonies agréable est disponible sans frais. Voir Liste du matériel pour les détails et les instructions d’installation. 4. Colonies bactériennes comte Logiciel sympa ouvert d’entrée Nom de l’opérateur, expérience informations et un dosage des Notes dans les champs vides. Après avoir entré ces données, cliquez sur le bouton fait . Importer des assiettes photographiées en cliquant sur le bouton ouvrir et sélectionner les fichiers corrects de l’ordinateur. Ajustez les paramètres de dosage en définissant le nombre de lignes à 4 et le nombre de colonnes à 12. Réglez le paramètre de contexte pour sigma-3 et la résolution à bas. Voir la Figure 2. Déplacez les régions d’intérêt (ROIs) en cliquant et glissant de sorte que chaque ROI est directement sur place un échantillon. S’assurer que toutes les colonies bactériennes sont à l’intérieur du ROI sans chevauchement entre les échantillons. Une fois un plat complet, double-cliquez sur la plaque suivante dans la liste d’Images de données stockées et ajuster la ROIs. Voir la Figure 2. Après ont réglé toutes les plaques, cliquez sur le bouton vert du comte , voir Figure 2 et Figure 3. Lorsque le décompte est terminé, cliquez sur le bouton exporter pour exporter les données au format.xls/.xlsx. Nommez et enregistrez le fichier.xls/.xlsx pour l’analyse des données. Organiser les données exportées dans un format de table afin que les chefs d’accusation sont organisés dans un tableau représentant la plaque 96 puits assay, voir le tableau 2. 5. calculer le titre SBA (KI) et mise à mort Non spécifiques (NSK) Remarque : Titre de SBA, ou l’index de mise à mort (KI) est définie comme l’inverse de la dilution du sérum qui tue 50 % des bactéries cibles. Calculer les 50 % tuant valeur seuil indice (KI) par une moyenne de l’UFC de puits de contrôle de complément actif (Ctrl B) et en divisant par 2. Calculer la CFU moyenne pour chaque dilution de l’échantillon qui a été exécuté en double, voir le tableau 3. Parce qu’une dilution du sérum donnera rarement exactement cette valeur KI de 50 %, il peut être interpolées à partir de deux dilutions du sérum séquentielle, celui qui tue au moins 50 % et celui qui tue plus de 50 %, voir la Figure 4. La formule pour calculer le KI de SBA interpolée est illustrée ci-dessous :Remarque : Le titre bactéricide, ou KI, peut également être calculé automatiquement à l’aide d’un logiciel Opsotiter développé par UAB. À demander Opsotiter, contacter Dr Moon Nahm ou M. Rob Burton. Voir https://www.vaccine.uab.edu pour obtenir les coordonnées. Calculer la valeur NSK en prenant 1 moins la moyenne de commande B divisé par la moyenne du contrôle A.

Representative Results

Une disposition de la plaque à 96 puits utilisée dans un essai typique est montrée en Table 1. Cette disposition a cinq échantillons, les puits de contrôle de complément inactivés par la chaleur (commande A) et les puits de contrôle de complément actif (Ctrl B) en double exemplaire. Les échantillons sont dilués en série 3 fois vers le haut la plaque de la ligne H à ramer un permettant pour 8 dilutions de l’échantillon à tester à la fois. La figure 1 montre deux plaques LBA après addition d’incubation et de superposition au jour le jour. Développement de la couleur a eu lieu, et toutes les colonies survivantes sont visibles en rouge. Mise à mort bactérienne est clairement visible pour tous les échantillons testés dans les trois premières dilutions (lignes F-H) et comme les échantillons sont dilués plus loin vers le haut de la plaque, une diminution de la mise à mort bactérienne est vu où le sérum est moins concentré. Interface logicielle NICE peut être vu dans la Figure 2. Nombre de micro-colonies du logiciel agréable peut être vu à la Figure 3, et ces chefs d’accusation ont été organisés dans le tableau 2. Le nombre d’UFC moyens pour chaque dilution de l’échantillon est calculé et une valeur KI de 50 % est calculée dans le tableau 3. Cette valeur KI de 50 % peut être appliquée à l’UFC en moyenne pour chaque dilution de sérum pour déterminer les valeurs nécessaires pour calculer le KI de SBA selon la formule décrite à la Figure 4. Le résultat final du test est indiqué dans le tableau 4. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Contrôle A Commande B Dilution 8 Dilution 8 Dilution 8 Dilution 8 Dilution 8 Dilution 8 Dilution 8 Dilution 8 Dilution 8 Dilution 8 B Contrôle A Commande B Dilution 7 Dilution 7 Dilution 7 Dilution 7 Dilution 7 Dilution 7 Dilution 7 Dilution 7 Dilution 7 Dilution 7 C Contrôle A Commande B Dilution 6 Dilution 6 Dilution 6 Dilution 6 Dilution 6 Dilution 6 Dilution 6 Dilution 6 Dilution 6 Dilution 6 D Contrôle A Commande B Dilution 5 Dilution 5 Dilution 5 Dilution 5 Dilution 5 Dilution 5 Dilution 5 Dilution 5 Dilution 5 Dilution 5 E Contrôle A Commande B Dilution 4 Dilution 4 Dilution 4 Dilution 4 Dilution 4 Dilution 4 Dilution 4 Dilution 4 Dilution 4 Dilution 4 F Contrôle A Commande B Dilution 3 Dilution 3 Dilution 3 Dilution 3 Dilution 3 Dilution 3 Dilution 3 Dilution 3 Dilution 3 Dilution 3 G Contrôle A Commande B Dilution 2 Dilution 2 Dilution 2 Dilution 2 Dilution 2 Dilution 2 Dilution 2 Dilution 2 Dilution 2 Dilution 2 H Contrôle A Commande B Dilution 1 Dilution 1 Dilution 1 Dilution 1 Dilution 1 Dilution 1 Dilution 1 Dilution 1 Dilution 1 Dilution 1 Échantillon 1 Échantillon 2 Exemple 3 Exemple 4 Échantillon 5 Tableau 1 : schéma test. Colonnes 1 et 2 contiennent les puits de contrôle de complément. Commande A est situé dans la colonne 1 et inactivés par la chaleur complément de contrôle, qui contient le tampon SBA, de bactéries et complément inactivés par la chaleur. Commande de B est situé dans la colonne 2 et est l’actif complément de contrôle, qui contient le tampon SBA, de bactéries et complément. Colonnes 3 à 12 contiennent des échantillons de sérum. Chaque échantillon est exécuté en double et en série dilué 3 fois de suite H à ligne A Figure 1 : plaques LBA après coloration. Représentant S. flexneri 3 a micro-colonies bactériennes sont passés du jour au lendemain à la taille appropriée. Gélose de recouvrement a été ajoutée et les colonies ont mis au point une couleur rouge par réduction du composé TTC dans une gélose de recouvrement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : interface du logiciel intégré colonie énumérateur (NICE) de la NIST. Représentation graphique de l’interface du logiciel sympa. Régions d’intérêt (ROIs) sont centrées sur les colonies pour chaque spot avant le dépouillement. Données peuvent être exportées directement à partir de la fenêtre de NICE. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : LBA plaques logiciel agréable compté dans. Les images de photo couleur sont chargés dans le logiciel agréable et unités formant colonies (UFC) sont comptées automatiquement. Cette image montre deux plaques LBA représentant avec leurs informations de compte de colonie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 185 167 145 151 122 134 119 142 124 115 113 123 1:17496 Dilution 8 186 152 145 138 132 135 108 116 100 119 105 109 1:5832 Dilution 7 179 160 145 135 109 120 54 55 71 75 79 89 1:1944 Dilution 6 193 153 146 138 87 105 5 6 6 9 19 30 1:648 Dilution 5 184 129 121 143 6 7 0 1 1 1 1 1 1:216 Dilution 4 180 145 22 24 2 3 3 1 1 0 0 0 1 : 72 Dilution 3 207 129 1 0 2 2 1 0 4 1 0 1 01:24 Dilution 2 201 140 0 0 0 0 1 1 1 0 4 4 1:8 Dilution 1 Contrôle A Commande B Échantillon 1 Échantillon 2 Exemple 3 Exemple 4 Échantillon 5 Tableau 2 : nombre de colonies bactériennes. Comtes d’UFC sont exportés à partir du logiciel sympa au format excel. Ces compteurs peuvent être organisés dans un tableau indiquant que les bactéries compte pour tous les échantillons dédoublés et les puits de contrôle. Contrôle A Commande B 148 128 131 120 118 1:17496 Dilution 8 189 147 142 134 112 110 107 1:5832 Dilution 7 NSK (CtrB/1-CtrA) : 22 % 140 115 55 73 84 1:1944 Dilution 6 50 % KI (CtrB/2) : 73 142 96 6 8 25 1:648 Dilution 5 132 7 1 1 1 1:216 Dilution 4 23 3 2 1 0 1 : 72 Dilution 3 1 2 1 3 1 01:24 Dilution 2 0 0 1 1 4 1:8 Dilution 1 Échantillon 1 Échantillon 2 Exemple 3 Exemple 4 Échantillon 5 Tableau 3 : calcul de la valeur seuil de 50 % KI et moyennes de l’échantillon en double. La valeur seuil de 50 % KI a été calculée en divisant par 2 la moyenne de tous les puits de contrôle B. Moyennes des doublons ont été calculés pour chaque dilution de l’échantillon qui a été exécuté en double exemplaire. NSK est également calculée. Figure 4 : schéma de l’interpolation linéaire. Le nombre de bactéries survivantes (axe y) à chaque dilution du sérum testé (axe x) sont tracée (black diamonds), et des points individuels sont reliés par la ligne noire mince, en pointillés. Les lignes horizontales solides et en pointillés indiquent 0 % et 50 % tuant, respectivement. Les dilutions du sérum au-dessus (Dilution 5) ci-dessous (Dilution 4), le tuant ligne de 50 % sont reliés par une ligne rouge et titre bactéricide (KI) est indiqué. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. KI DE SBA Échantillon 1 72 Échantillon 2 216 Exemple 3 1994 Exemple 4 1994 Échantillon 5 648 Tableau 4 : SBA résultats montrant titre bactéricide (KI). Les valeurs finales de SBA KI ont été déterminées pour chaque échantillon et sont indiqués. Ces valeurs sont calculées à l’aide de l’UFC moyenne, la valeur seuil de 50 % KI et la formule d’interpolation linéaire.

Discussion

Le protocole décrit ici montre un test fonctionnel système immunitaire afin d’évaluer l’activité shigellacidal des anticorps dans le sérum. Dans l’analyse démontrée pour ce protocole des anticorps monoclonaux spécifiques pour 3 a S. flexneri étaient utilisés9 avec Séra humains d’un vaccin de Shigella précédent étude11. La source du sérum testé dans cet essai peut varier largement d’échantillons animaux pré-cliniques à échantillons cliniques humains, et l’activité shigellacidal de l’échantillon de sérum est touchée par les vaccinations et les expositions que l’individu a vécu. On peuvent s’attendre à quelques réactions croisées entre sérotypes étroitement apparentées, notamment S. flexneri 2 a et 3 a S. flexneri , mais peu de réactivité croisée a été observée chez ces souches par rapport à S. sonnei9. La base de l’ASB se concentre sur l’activation de la cascade du complément par liaison anticorps-antigène. Par conséquent, la manipulation du réactif BRC est l’une des nombreuses étapes critiques impliqués dans l’exécution du présent protocole. BRC a été sélectionné pour une utilisation dans cet essai à cause de ses performances constantes et faibles concentrations de NSK dans autres essais bactéricide12,13,14.  L’activité de BRC est sensible à la température et des mesures appropriées doivent être prises pour s’assurer que la gel dégel cycles sont réduits au minimum, que le BRC est aliquoté en volumes à usage unique, et que les aliquotes BRC sont décongelées rapidement, immédiatement avant utilisation dans l’essai. La cohérence des activités de complément affectera la reproductibilité de ce test. Une autre étape cruciale qui touchent la reproductibilité du dosage est la production et la dilution des stocks bactériennes. Il est important qu’avant de commencer le test la dilution appropriée de stocks bactériennes est déterminée, comme succès de dosage sont selon la production régulière des contrôles A et B d’UFC comtes en moyenne 120 ~ UFC par endroit. Afin d’obtenir des taches qui sont dénombrables par le logiciel, il est également impératif que la technique utilisée pour les bactéries de la plaque est exécutée avec succès. Le dépôt de la solution bactérienne et l’inclinaison de la plaque pour que les taches exécutent ~ 2-3 cm est critique pour la production de colonies de la distribution droite taille et correcte pour un comptage précis par le logiciel sympa. Maîtrise de toutes ces étapes veillera à ce que des résultats précis et cohérents sont produites par le présent protocole

Même lorsque toutes les étapes critiques sont exécutées bien il peut encore être les instances où il est nécessaire de modifier ou dépanner ce protocole. Modifications du présent protocole pour évaluer d’autres bactéries peuvent nécessiter l’optimisation de la température pendant la nuit pour la d’incubation sur le plaque LBA, afin d’assurer la formation de micro-colonies. Autres souches des bactéries ou des anticorps sources, autres que de sérum, peuvent exiger l’optimisation de la concentration de complément. Valeurs NSK et KIs des sérums de contrôle doivent également être surveillées pour s’assurer que le test fonctionne convenablement. NSK ne devrait pas augmenter plus 70 %. Le KI de contrôle sérums ne devraient pas varier signifie plus de ± 2et. Pour obtenir des résultats fructueux et cohérentes lors de l’utilisation de ce protocole, il sera nécessaire d’effectuer toutes les étapes comme décrit ici, avec une attention particulière pour les étapes critiques décrites ci-dessus.

Alors que ce protocole comble un besoin important dans la communauté de recherche de Shigella , il n’est pas sans ses limites. Ce protocole s’appuie sur des matériaux biologiques et, par conséquent, sera toujours une variabilité qui est difficile à contrôler. Variations dans l’activité de complément de lots différents et sources peuvent contribuer à la variabilité dans les essais. Pour atténuer ce, il est important de traiter de manière appropriée complément et tester de nouveaux lots de complément pour l’activité avant de l’acheter. Il peut également être utile de créer des pools de lots de complément avec l’activité connue afin d’obtenir un approvisionnement homogène. Ce protocole est simple de conception et ne nécessite aucun équipement spécialisé et la colonie automatisée énumérant le logiciel est disponible gratuitement. Cette simplicité est un avantage, permettant à ce protocole à utiliser dans pratiquement n’importe quel laboratoire, s’il toujours nécessite une incubation durant la nuit. Des essais récents ont été décrites qui ont beaucoup besoin d’incubation plus courte, mais requièrent réactifs spécialisés, préparatoires15. Une autre limitation de ce test, c’est que, dans sa forme actuelle, il est seulement capable d’examiner une seule espèce bactérienne à la fois. Dans le domaine de Shigella , il y a une volonté de créer un vaccin multivalent et ayant des tests immunologiques qui peuvent évaluer des agents pathogènes de manière multiplexe est d’une grande valeur. Ce test pourrait être modifié à l’avenir pour répondre à ce besoin, mais dans sa forme actuelle, c’est un test simple-plex.

Bien que cet essai a quelques limitations, il a encore beaucoup d’avantages par rapport aux méthodes existantes ou alternatives. Ces avantages comprennent de nombreuses améliorations qui se combinent pour rendre l’exécution de cette méthode beaucoup moins fastidieuse et plus haut débit que SBAs traditionnels. L’utilisation des stocks bactériennes figés, un format d’essai de plaque à 96 puits, le placage sur les plus grandes boîtes de pétri carrées, la coloration des colonies qui permet de photographier et colonie-comptage automatique, contribuent à réduire les matériaux et le temps nécessaire pour effectuer ce dosage. Ce dosage a également des avantages par rapport aux autres méthodes de haut-débit car elle ne nécessite pas de tout matériel et réactifs spécialisés. Le protocole décrit peut être effectué avec les réactifs de base et les logiciels librement disponibles, permettant son application dans n’importe quel arrangement de laboratoire.

Tous les avantages que propose ce protocole prend en charge son utilisation dans nombreuses enquêtes futures. Le dosage est idéal pour l’examen de la réponse immunitaire après la vaccination ou une infection naturelle. Cette application permet de la SBA, à être un outil précieux pour la recherche sur les vaccins Shigella et a déjà été utilisée pour évaluer l’immunogénicité des vaccins dans les vaccins de bio-conjugué de Shigella où il a démontré la capacité de ces vaccins à induire la production d’anticorps fonctionnels16. Ce protocole a été largement testé par plusieurs laboratoires et a été montré pour produire des résultats fiables et reproductibles,9. Ce protocole produit également des résultats comparables, lorsque les mêmes échantillons sont testés à l’aide d’autres dosages bactéricide17. L’uniformité des données générées par cet essai, et sa compatibilité avec d’autres méthodes plus âgés en fait un outil robuste pour évaluer avec précision l’activité bactéricide dans le sérum. Le dosage peut être facilement adapté pour évaluer les types d’échantillons supplémentaires. Tandis que le sérum est facilement disponible dans les essais cliniques adultes, il peut être difficile d’obtenir le sérum suffisante dans les essais en se concentrant sur les nourrissons et enfants en bas âge ; une des populations cible éventuelle pour les vaccins de Shigella . Dans ces essais, sang entier est systématiquement recueilli sur un papier filtre et séché. Il y a eu certain succès préliminaire avec ce type de format d’échantillon à l’aide de l’ASB. En plus de sang, des échantillons de muqueuses (comme la salive, extraits de matières fécales et l’urine) sont également une cible qui est pertinente dans la recherche sur les vaccins Shigella . Actuellement, ce protocole a été évalué pour trois sérotypes plus cliniquement pertinente du Shigella mais il peut aussi être adapté pour des Shigella SPP., mais aussi les autres bactéries pathogènes. Travaux futurs seront concentrera sur la production d’un essai multiplex avec beaucoup des mêmes caractéristiques que le dosage indiqué par le présent protocole. Un dosage multiplexé permettra pour l’évaluation de plusieurs sérotypes de Shigella simultanément, conservation plus volume des échantillons et les mains sur les temps de dosage. Il y a aussi des travaux en cours pour transférer cette analyse aux laboratoires à travers le monde. Ces évaluations mondiales vont générer plus de données vers le test sur une plus grande échelle de la recherche, tout en augmentant le nombre de laboratoires de microbiologie et d’immunologie qui ont accès à ce SBA pour évaluer les bactéries et le sérum de qualification des échantillons recueillies à différents sites endémiques. L’essai décrit ici est simple et haut-débit et a la capacité d’améliorer l’évaluation immunologique dans le champ de Shigella , ainsi que des applications plus larges à l’évaluation d’autres bactéries pathogènes.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par une bourse de chemin d’accès au M.H.N. Cette étude a été menée comme une coopérative de recherche et développement a conclue le Walter Reed Army Institute of Research et l’Université d’Alabama à Birmingham.

Materials

Gelatin Sigma G9391 Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) Sigma T8877 ≥98.0% (HPLC)
Sodium azide (NaN3) Sigma S2002 ≥99.5%
Baby Rabbit Complement PelFreez 31061-3 3-4 week old
HBSS with Ca2+/Mg2+ Invitrogen 14065-56 Without Phenol Red
LB Agar (Lennox) Sigma L2897 Powder microbial growth medium
Bacto Agar BD 214010 Powdered, (C12H18O9)n
Glycerol Sigma G5516 For molecular biology, ≥99%
LB Broth (Lennox) Sigma L3022 Powder microbial growth medium
Square Petri Dish Sigma Z617679-240EA 120 mm x 120 mm
Assay Plate Costar 3799 96 well u-bottom plate with lid
NICE Software University of Alabama at Birmingham ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/
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References

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Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).
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