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Immunology and Infection

Um do elevado-throughput Shigella-ensaio bactericida específico

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59164
, , ,
1Department of Enteric Infections, Bacterial Diseases Branch,Walter Reed Army Institute of Research, 2University of Alabama at Birmingham

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para medir a atividade Shigellacidal de anticorpos no soro. Soro é misturado com bactérias e complemento exógeno, incubado, e a mistura de reação é revestida em placas de ágar. Bactérias viáveis formam colônias que são contadas, usando um enumerador de colônia automatizado e usado para determinar a concentração bactericida.

Abstract

Ensaios bactericidos do soro (SBAs) medem a atividade funcional de anticorpos e têm sido utilizados por muitas décadas. SBAs diretamente medem a atividade de abate de anticorpo avaliando a capacidade de anticorpos no soro para vincular às bactérias e ativar o complemento. Essa ativação do complemento resulta a Lise e a morte da bactéria alvo. Estes ensaios são valiosos porque eles vão além de quantificar a produção de anticorpos para elucidar as funções biológicas que possuem Estes anticorpos, permitindo aos pesquisadores estudar o papel que os anticorpos podem desempenhar na prevenção da infecção. SBAs têm sido usados para estudar as respostas imunes para muitos patógenos humanos, mas não há nenhuma metodologia amplamente aceita para Shigella neste momento. Historicamente, SBAs têm sido muito trabalhosos, que exige muitas etapas demoradas de quantificar com precisão as bactérias sobreviventes. Este protocolo descreve um simples, robusto, e elevado-throughput do ensaio que medidas funcionais de anticorpos específicos para Shigella no soro in vitro. O método descrito aqui oferece muitas vantagens sobre o tradicionais SBAs, incluindo o uso de populações bacterianas congelados, 96 bem ensaio de chapas, sistema de microcultura e automatizado de contagem de colônia. Todas essas modificações fazem este ensaio menos trabalhosa e mais elevado-throughput. Este protocolo é mais simples e rápido de realizar do que tradicional SBAs enquanto ainda estiver usando tecnologias simples e reagentes prontamente disponíveis. O protocolo foi aplicado com sucesso em vários laboratórios independentes e o ensaio é robusto e reprodutível. O ensaio pode ser usado para avaliar as respostas imunes em estudos pré-clínicos, bem como clínicas. Quantificação dos anticorpos shigellacidal, tanto antes como após a exposição de antígeno (seja pela vacinação ou infecção) permite uma compreensão mais ampla do anticorpo como funcional, respostas são geradas e sua contribuição para a imunidade protetora. O desenvolvimento deste padronizado, ensaio bem caracterizado pode facilitar grandemente a projeto de vacina de Shigella .

Introduction

Sorotipos de Shigella , Shigella flexneri 2a, 3a S. flexneri e S. sonnei, demonstram prevalência epidemiológica globalmente. A doença diarreica causada por estes Shigella espécies impactos militares, viajantes1e é das principais causas de morte diarreica entre crianças menores de 5 anos de idade em países em desenvolvimento2. Existem actualmente não licenciadas vacinas para proteger contra Shigella, no entanto, existem várias vacinas do candidato em vários estágios do desenvolvimento. Muitas dessas vacinas e outras medidas profiláticas, atualmente em desenvolvimento, focar a anticorpos produzidos contra Shigella lipopolissacarídeo (LPS). LPS é um candidato atraente vacina porque é um antigénio de superfície grande e natural infecção por Shigella induz anticorpos LPS-específicos que podem ser protetoras contra re-infecção de forma sorotipo-específica. Portanto, uma vacina bem sucedida de Shigella provavelmente precisará ser multi-valente e alvo 3-4 que sorotipos de Shigella para induzir imunidade contra 70-80% globalmente circulantes de cepas3,4, 5 , 6. isto exige que ensaios para avaliar candidatos vacinais de Shigella seja específica para vários sorotipos diferentes.

Testes imunológicos atuais para avaliar candidatos vacinais focar quantificação dos níveis de anticorpos, mas existem alguns ensaios bem caracterizados para avaliar anticorpos funcionais. A análise da capacidade funcional de anticorpo é importante porque os anticorpos específicos do patógeno são responsáveis pela luta contra a infecção através de vários mecanismos funcionais, incluindo a ligação de antígenos de superfície de bactérias e impedindo a adesão ao e infecção de células epiteliais, visando as células bacterianas ou opsonização e fagocitose e diretamente, matando patógenos pela vinculação e iniciar a cascata do complemento. O abate direto de bactérias por anticorpos ocorre quando anticorpos ligam-se aos componentes de superfície das bactérias alvo e iniciar a cascata do complemento levando à ativação de muitos zymogens, que em última análise, resultam em formação de poros no bacteriano célula que provoca a morte de Lise e bacteriana. Esta matança direta de bactérias por anticorpos e complemento de circulação pode ser uma linha de início crucial de defesa durante a infecção.

Os indivíduos que são naturalmente infectados têm anticorpos com atividade shigellacidal em seus soros. Estes anticorpos específicos Shigella –foram detectados usar tradicional matança mediada por complemento ensaios 7,8. Isto indica que pode haver um papel para anticorpos bactericidos na proteção contra Shigella. Ensaios de bactericida tradicionais são simples na sua execução: soro é inativado por calor (para destruir a atividade endógena complemento) e misturado com as bactérias de interesse. Complemento exógeno é adicionado a esta mistura em uma concentração específica. A mistura de reação é incubada para permitir a morte bacteriana e chapeada então para confirmar as unidades formadoras de Colônia (CFUs). Uma vez CFUs são contados, um índice de morte de 50% (KI) pode ser calculado e uma titulação de SBA determinado. Enquanto esse procedimento é relativamente simples, estes ensaios podem ser trabalhosa e demorada realizar e os resultados podem ser altamente variáveis. Além dessas limitações, existem atualmente não há ensaios funcionais bem caracterizados para Shigella. Portanto, temos com sucesso desenvolvido e qualificado de um ensaio simples, elevado-throughput para medir a atividade bactericida de Shigella por três das estirpes mais clinicamente relevantes9. Este protocolo descreve um SBA com modificações que melhoram a eficiência de ensaio e reprodutibilidade. A primeira destas modificações é o uso de populações bacterianas congelados. A produção de estoques de uso único elimina a necessidade de bactérias fresco de cultura para cada ensaio, também reduzindo a variabilidade de ensaio-para-ensaio. Outro tempo e trabalho salvando a vantagem deste protocolo é o uso de um formato de ensaio de placa de 96 poços. Isto permite serial diluição das amostras para que uma gama de concentrações pode ser testada.  Também permite o uso de pipetas multicanais para chapeamento exemplos em pratos de Petri quadrados. Quando estes pratos de Petri quadrados são usados em conjunto com um sistema de cultura que produz microcolônias, é reduzir o número de placas de ágar, necessária para o ensaio. Isto, em combinação com software de contagem de colônia livremente disponível, originalmente desenvolvido para o opsonophagocytic multiplexado pneumocócica matando ensaio (MOPA)10, permite a enumeração de colônia rápido, automatizado e confiável. Todas estas melhorias reduzem significativamente o tempo de ensaio hands-on e criando um sistema de alta produtividade, permitindo múltiplas placas ser executado ao mesmo tempo.

Enquanto este protocolo foi otimizado para três dos serótipos mais clinicamente relevantes de Shigella, a SBA descrito aqui pode ser facilmente aplicado a muitos outros patógenos bacterianos. Além do uso potencial do presente protocolo com outras bactérias, este protocolo tem o potencial para expandir para além de usar apenas o soro como matéria-prima, que pode incluir a análise de anticorpos em outros tipos de amostra relevantes como amostras da mucosa, incluindo a saliva e amostras fecais. O uso deste teste para investigar respostas imunológicas após a vacinação pode dar mais amplo insight respostas imunes gerado pela vacinação levando o projeto racional de vacinas, e ajuda na compreensão da imunidade natural como se desenvolve.

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes do Conselho de proteção do sujeito humano WRAIR. Amostras utilizadas neste estudo são amostras de soro humano coletadas como parte do número do protocolo do WRAIR 1328, em conformidade com todas as regulamentações federais e institucionais que regem a proteção de assuntos humanos. As amostras foram identificadas de, e o uso destas amostras anônimo foi classificado como não-humanos sujeito pesquisa pela UAB IRB (número de protocolo N150115001). 1. preparar os reagentes do ensaio Prepare-se 1% gelatina pela adição de 1 g de gelatina para 100 mL de água. Autoclave e armazenar à temperatura ambiente. Prepare 100 mg/mL solução stock de TTC (cloreto de 2,3,5-Triphenyltetrazolium) (1, 000 x) pela adição de 5 g de TTC para 40 mL de água. Quando o TTC é totalmente dissolvido, ajuste o volume para 50 mL com água e filtro estéril usando filtro de 0,2 µm. Armazenar a solução a 4 ° C e proteger da luz.Nota: TTC colore as colônias bacterianas e torna-los mais fácil de contar. Solução TTC tem uma ligeira cor amarela. Se solução TTC desenvolve uma cor vermelha, descartar e prepare-se fresco. Prepare a solução de estoque (100 x) (NaN3) azida de sódio de 10% pela adição de 5 g de NaN3 a 40 mL de água. Após dissolução completa, adicione água a 50 mL. Armazenar em temperatura ambiente.Atenção: Azida de sódio é um veneno e pode ser tóxica se ingerido ou absorvido através da pele ou olhos. Ele pode reagir com chumbo ou cobre para formar azidas metálicas altamente explosivas. Na eliminação dos reagentes contendo azida sódica, lave com um grande volume de água para evitar a acumulação de azidas ou descartar em um saco de risco biológico. Prepare a placa LBA (placa de ágar LB) pela adição de 35 g de ágar-ágar LB para 1 L de água e autoclave. Adicione 25 mL de cada placa de Petri quadrada (120 x 120 mm2). Incube placas em RT para 10-20 min para permitir que o ágar solidificar. Colocar placas em sacos de plástico e loja a 4 ° C por até 1 mês. Prepare ágar Overlay adicionando 7,5 g de ágar-ágar a 1.000 mL de água e autoclave. Incube em banho de água de 56 ° C até ser necessário. Bem antes de usar, adicione 1 mL de 100mg/mL TTC e 10 mL de 10% NaN3 e misture bem.Nota: Cada placa LBA precisa de 25 mL de ágar Overlay. Gelose pode ser preparado até para um mês de antecedência e derretido no microondas ou em uma chapa quente conforme necessário para o ensaio. Certifique-se de que a temperatura de ágar-ágar é ~ 55 ° C antes da aplicação para placas LBA. Prepare o Buffer de ensaio, adicionando 5 mL de 10 x Hanks equilibrado sal solução (HBSS) com Ca2 +/ mg2 + e 5 mL de 1% de gelatina para 40 mL de água. Armazenar em temperatura ambiente. 2. prepare o complemento e bactérias-alvo Prepare o coelho bebê complemento (BRC)Nota: Detalhada de critérios para seleção de monte de complemento pode ser encontrada aqui: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf Obter BRC congelado e descongele com água corrente fria. Fisicamente, misturar o BRC cada ~ 10-20 min até completamente derretido. Não exponha o BRC a ciclos de descongelamento repetidos congelamento. Enquanto o BRC é descongelar, rotule tubos de centrífuga de 1,5 mL, 5mL ou 15 mL. Lugar rotulado tubos no gelo para pre-cool. Volume adequado alíquota BRC para os tubos de centrífuga pre-cooled (após o enchimento, imediatamente retornar cada tubo de gelo). Loja alíquotas a ≤-70 ° C no congelador.Nota: Aproximadamente 1 m do complemento é necessária para cada placa de ensaio. Alíquotas de complemento são para uso único e devem ser aliquotadas em volumes adequados a ensaiar layouts de. Para preparar o BRC inactivados por calor, descongele uma alíquota de ativo BRC. Prepare um banho de água de 56 ° C. Depois BRC é completamente derretido, transferi-lo para o banho de água e incube por 30 min. Após a incubação, remover BRC inactivadas pelo calor do banho e deixar arrefecer no RT de 10-15 min.. Misture vigorosamente e alíquota µ l ~ 150 para tubos de 1,5 mL microcentrifuge. Armazenar as alíquotas a ≤-10 ° C. Preparar o alvo estoque de bactériasNota: O procedimento a seguir é usado para preparar 48 alíquotas de estoque de bactérias do alvo; Se forem necessários mais alíquotas o protocolo pode ser ampliado. Remova as bactérias estoque mestre frasco do congelador e raspe a superfície bacteriana congelada para remover uma pequena quantidade de gelo do frasco em uma placa de ágar sangue. Volte imediatamente o frasco de estoque mestre para o congelador. Marcam esta pequena alíquota do estoque bacteriana para a placa de ágar sangue e cubra com a tampa da placa. Incube a placa de cabeça para baixo durante a noite em 37 °C/5% CO2 incubadora. Transferência de ~ 10 colónias lisas isoladas para um tubo de 50 mL contendo 30 mL de caldo LB. Incube durante 3-5 h a 37 ° C, com agitação suave até que o caldo de cultura tem uma OD600 de ~0.6-0,7. Colheita do topo 12,5 mL da cultura e da transferência de um tubo 50 mL. Centrifugar a cultura a 15.000 x g por 2 min usando uma microcentrífuga de mesa. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 25 mL de glicerol estéril de 15%-LB. Misture bem e dispense alíquotas de 0,5 mL em tubos de centrífuga micro estéril 1,5 mL (~ 48 tubos). Loja alíquotas a ≤-70 ° C no congelador. Confirme a identidade bacteriana utilizando o teste de aglutinação antes do uso. Determinação do factor de diluição ideal para o estoque de bactérias do alvoNota: Cada lote de estoque de bactérias alvo deve ser titulado em condições de ensaio para determinar a diluição necessária para produzir ~ 120 CFU/spot em placas LB. Obter uma placa de microtitulação (placa de diluição) e adicione 135 µ l de Buffer de ensaio para bem a 1A. Adicione 120 µ l de manteiga de ensaio para poços 1B – 1H. Retire um frasco de bactérias alvo congelado do freezer e descongelar à temperatura ambiente. Adicione 15 UL de ações bacterianas descongelada para bem 1A para fazer uma diluição de 10 vezes das ações bacterianas. Transferi 30 µ l de solução bacteriana de bem 1A a 1B bem para realizar uma diluição serial 5-fold. Continue 5-fold diluições em série para bem 1h para um total de 8 diluições (01:10 01:50 1: 250; 1:250 1; 1:250 6; 1:250 31; 1:250 156; 1:781 250). Pegar outra placa de microtitulação (placa de ensaio) e adicionar 20 µ l de Buffer de ensaio para tudo bem nas colunas 1 e 2 na placa de ensaio. Transferi 10 µ l de bactérias diluídas de cada poço na coluna 1 da placa de diluição para os poços correspondentes nas colunas 1 e 2 da placa de ensaio. 10 µ l de bactérias é transferido do bem 1A da placa de diluição para bem 1A e 2A no ensaio de placa, etc. Continue com o ensaio conforme descrito no ensaio bactericida soro (SBA) abaixo para controle A e B do controle, passos 3.6-3.12. Depois que as placas têm sido incubadas no gelo, use uma pipeta multicanal com 8 pontas de pipetas para detectar 10 µ l dos poços na coluna 1 em um prato LBA. Também, identificar os poços da coluna 2 na placa de LBA. Continue com o ensaio conforme descrito a seguir em passos 3.14-4.6. Determine a diluição de bactérias que produz ~ 120 que CFU/spot no controle B, esta diluição será usado no ensaio. 3. soro ensaio bactericida (SBA) Nota: O procedimento descrito abaixo é para uma placa de ensaio, mas o número de placas de ensaio pode ser aumentado. Calor-inativar testar amostras pela incubação de amostras em um banho de água de 56 ° C durante 30 min.Nota: Amostras de teste devem ser inactivadas pelo calor antes do teste para revogar qualquer atividade complementar endógena. Isso pode ser feito antes do ensaio e amostras inactivadas podem ser re-congeladas ou armazenadas a 4 ° C até testado. Uma placa de ensaio e adicionar 20 µ l de Buffer de ensaio para colunas de 1 a 12 de linhas A através de G. Adicionar 20 µ l de Buffer de ensaio para as colunas 1 e 2 da linha H, ver tabela 1. Carrega 30 µ l de cada amostra, em duplicado, a linha H da placa de ensaio. Por exemplo, dispense 30 µ l de amostra 1 em poços 3 H e 4 H e dispense 30 µ l de amostra 2 em poços 5 H e 6 H, etc. Execute 3 vezes diluições em série de amostras de teste, usando uma pipeta multicanal. Remover 10 µ da amostra de poços 3H – 12H e transferência para poços correspondentes na linha G e misturar a amostra bem pipetando para cima e para baixo 8 – 10 vezes. Em seguida remover 10 µ de poços 3G – 12g e transferência para poços correspondentes na linha F e misture bem. Continuar estas diluições em série através da linha A. Após a mistura dos poços na linha A, remova e descarte a 10 µ l de poços 3A-12A para que todos os poços contenham 20 µ l.Nota: Porque 20 µ l de soro é usado em um volume total de ensaio de 80 µ l, há uma 4-fold diluição adicional no ensaio. Esta diluição deve ter em conta durante o cálculo de um título de SBA multiplicando a diluição do soro por 4. Por exemplo, se uma diluição inicial de 1:2 é usada, a diluição real sendo testada é 1:8. Remova um frasco de estoque de bactérias alvo congelado e descongelar à temperatura ambiente. Dilua as bactérias em 20 mL de tampão de ensaio de acordo com o fator de diluição ideal pré-determinado (esse fator de diluição foi determinado na seção 2.3). Adicione 10 µ l de bactérias diluídas a cada poço da placa de ensaio, utilizando uma pipeta multicanal. Retire um frasco de BRC congelado e um frasco de congelados-inactivados por calor, BRC, descongelar à temperatura ambiente com água corrente fria ou coloque na grelha de uma câmara de segurança biológica do armário com sopro de ar para descongelar rapidamente. Prepare uma solução de 20% da BRC inactivadas pelo calor. Mix 100 µ l de BRC inactivadas pelo calor com 400 µ l de Buffer de ensaio. Adicione 50 µ l desta solução de BRC 20% inactivadas pelo calor a todos os poços na coluna 1 (controle A poços).Nota: BRC inactivados por calor, é usado como um controle para monitorar a matança não-específica (NSK) no ensaio. Prepare uma solução de 20% da BRC nativo. Misture 1 mL de BRC nativo com 4 mL de tampão de ensaio. Adicione 50 µ l de mistura para todos os poços nas colunas 2 a 12 (poços de amostra B de controle e teste).Nota: A concentração final de BRC na mistura de reação é de 12,5%. Brevemente misture placa de ensaio agitando suavemente para 10-15 s num agitador de placa ou misturar pipetando e descer 8 vezes usando uma pipeta multicanal. Colocar a placa de ensaio na incubadora microbiológica de 37 ° C por 2 h (sem agitação). Seca 2 placas LBA, removendo as tampas e colocando placas enfrentam segurança microbiológica para 40-60 min. Quando a incubação de 2 h for concluída, mova a placa de ensaio molhado gelo e incubar por 10-20 min parar a reação. Utilizando uma pipeta de 12 canais, misture os poços na linha H e a placa local 10 µ l da mistura de reação para o fundo de uma placa LBA. Imediatamente incline a placa e permitem que as manchas correr para ~1.5-2 cm. Repita este procedimento para linha G, F e E detectá-las acima da linha anterior na placa LBA. Linha E, F, G e H são manchadas em uma placa LBA e linha A, B, C e D são manchadas em uma segunda placa LBA da mesma forma, veja a Figura 1. Incube as placas LBA em temperatura ambiente até que a solução é adsorvida nas placas LBA (10-15 min). Colocar as tampas nas placas LBA e colocar as placas LBA na incubadora microbiológica de ponta-cabeça para incubar durante uma noite (~ 16-18 h). Incubar a S. flexneri 2a e 3a a 29 ° C e incubar S. sonnei é a 26 ° C.Nota: Estas temperaturas rendem “microcolônias menores” com tamanhos apropriados para contagem exata por um contador de colônia9. Após a incubação durante a noite, adicione 25 mL de ágar Overlay (a ~ 55 ° C) contendo 100 µ g/mL TTC e 0,1% NaN3 para cada placa LBA. Incube as placas LBA a 37 ° C por 2 h permitir que as bactérias sobreviventes para desenvolver a cor vermelha, veja a Figura 1 abaixo. Fotografar as placas usando uma câmera digital e transferir imagens para um computador onde foi instalado colônia enumerando Software integrado do NIST (NICE), ver Figura 2.Nota: BOA contagem de colônia software está disponível sem nenhum custo. Consulte a Lista de materiais para detalhes e instruções de instalação. 4. contagem de colônias de bactérias Open Software legal e entrada Nome de operador, informações do experimento e qualquer ensaio notas para os campos vazios. Uma vez que este dados são inseridos, clique no botão feito . Importe placas fotografadas clicando no botão abrir e selecionar os arquivos corretos do computador. Ajuste os parâmetros de ensaio, definindo o número de linhas para 4 e o número de colunas para 12. Ajuste a configuração de plano de fundo ao sigma-3 e a resolução para baixo. Consulte a Figura 2. Mova a regiões de interesse (ROIs), clicando e arrastando para que cada ROI está diretamente sobre o ponto de uma amostra. Certifique-se de que todas as colônias bacterianas estão dentro o ROI com nenhuma sobreposição entre as amostras. Concluído um prato, dê um duplo clique a seguinte placa na lista de imagens de dados armazenados e ajustar o ROIs. Consulte a Figura 2. Quando todas as placas foram ajustadas, clique no botão verde de contagem , veja a Figura 2 e Figura 3. Quando a contagem terminar clique no botão Exportar para exportar os dados no formato.xls/.xlsx. Nomeie e salve o arquivo.xls/.xlsx para análise de dados. Organizar exportados dados em um formato de tabela, para que acusações são organizadas em uma tabela que representa a placa de 96 poços de ensaio, ver tabela 2. 5. calcular o Titer SBA (KI) e matar não-específica (NSK) Nota: Título de SBA, ou índice de mortes (KI) é definida como a recíproca da diluição do soro que mata 50% da bactéria alvo. Calcule a 50%, matando o valor limite de índice (KI) em média a CFU de poços de controle do complemento ativo (Control B) e dividindo por 2. Calcular a média CFU por cada diluição de cada amostra que foi executada em duplicado, consulte a tabela 3. Porque uma diluição do soro raramente produzirá exatamente esse valor KI de 50%, que podem ser interpolados de duas diluições do soro sequencial, que mata a menos de 50% e que mata mais de 50%, veja a Figura 4. A fórmula para calcular o KI SBA interpolados é mostrada abaixo:Nota: A concentração bactericida, ou KI, também pode ser calculado automaticamente usando o software de Opsotiter desenvolvido pela UAB. Para solicitar Opsotiter, entrar em contato com o Dr. Moon Nahm ou Sr. Rob Burton. Consulte https://www.vaccine.uab.edu para informações de contato. Calcular o valor NSK tomando 1 menos a média de controle B dividido pela média de controle A.

Representative Results

Um layout de placa de 96 poços usado em um ensaio típico é mostrado no tabela 1. Este layout tem poços de controle do complemento ativo (Control B), poços de controle do complemento inactivados por calor (controle A) e cinco amostras em duplicado. As amostras são diluídas em série 3 vezes até a placa de linha a linha um permitindo 8 diluições de cada amostra para serem testadas ao mesmo tempo. A Figura 1 mostra duas placas LBA após a adição de incubação e superposição de durante a noite. Desenvolvimento de cor tem tido lugar e todas as colônias sobreviventes são visíveis em vermelho. Morte bacteriana é claramente visto para todas as amostras testadas nas três primeiras diluições (linhas F-H) e que as amostras são diluídas pouco mais acima da placa, uma diminuição na morte bacteriana é vista onde o soro é menos concentrado. Interface de software legal pode ser visto na Figura 2. Microcolônia contagens do bom software podem ser vistas na Figura 3, e essas contagens foram organizadas na tabela 2. A contagem média de UFC para cada diluição de cada amostra é calculada e um valor KI de 50% é calculado na tabela 3. Esse valor KI 50% pode ser aplicado para os CFUs em média para cada diluição do soro para determinar os valores necessários para calcular o KI SBA de acordo com a fórmula descrita na Figura 4. O resultado final do ensaio é mostrado na tabela 4. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Controle A Controle B Diluição 8 Diluição 8 Diluição 8 Diluição 8 Diluição 8 Diluição 8 Diluição 8 Diluição 8 Diluição 8 Diluição 8 B Controle A Controle B Diluição 7 Diluição 7 Diluição 7 Diluição 7 Diluição 7 Diluição 7 Diluição 7 Diluição 7 Diluição 7 Diluição 7 C Controle A Controle B Diluição 6 Diluição 6 Diluição 6 Diluição 6 Diluição 6 Diluição 6 Diluição 6 Diluição 6 Diluição 6 Diluição 6 D Controle A Controle B Diluição 5 Diluição 5 Diluição 5 Diluição 5 Diluição 5 Diluição 5 Diluição 5 Diluição 5 Diluição 5 Diluição 5 E Controle A Controle B Diluição 4 Diluição 4 Diluição 4 Diluição 4 Diluição 4 Diluição 4 Diluição 4 Diluição 4 Diluição 4 Diluição 4 F Controle A Controle B Diluição 3 Diluição 3 Diluição 3 Diluição 3 Diluição 3 Diluição 3 Diluição 3 Diluição 3 Diluição 3 Diluição 3 G Controle A Controle B Diluição 2 Diluição 2 Diluição 2 Diluição 2 Diluição 2 Diluição 2 Diluição 2 Diluição 2 Diluição 2 Diluição 2 H Controle A Controle B Diluição 1 Diluição 1 Diluição 1 Diluição 1 Diluição 1 Diluição 1 Diluição 1 Diluição 1 Diluição 1 Diluição 1 Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Tabela 1: layout da placa de ensaio. Colunas 1 e 2 contêm os poços de controle do complemento. Controle A situa-se na coluna 1 e é o calor-inativado complementar de controle, contendo tampão SBA, bactérias e complemento inactivadas pelo calor. Controle B situa-se na coluna 2 e é o ativo complementar de controle, contendo tampão SBA, bactérias e complemento. Colunas de 3-12 contêm amostras de soro. Cada amostra é executada em duplicado e serialmente diluída 3 vezes da linha H com a linha A Figura 1: placas LBA após o desenvolvimento de cor. Representante S. flexneri 3a microcolônias bacterianas têm crescido durante a noite para o tamanho adequado. Gelose foi adicionado e colônias desenvolveram uma cor vermelha por redução do composto em gelose TTC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: interface de software integrado colônia enumerador (NICE) do NIST. Representação gráfica da interface do software legal. Regiões de interesse (ROIs) estão centradas sobre colônias por cada vaga antes da contagem. Dados podem ser exportados diretamente da janela agradável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: LBA placas contados em Software legal. As imagens de fotografia de cor são carregadas no software agradável e unidades formadora de Colônia (CFUs) são contadas automaticamente. Esta imagem mostra duas placas representativas do LBA com suas informações de contagem de colônia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 185 167 145 151 122 134 119 142 124 115 113 123 1:17496 Diluição 8 186 152 145 138 132 135 108 116 100 119 105 109 1:5832 Diluição 7 179 160 145 135 109 120 54 55 71 75 79 89 1:1944 Diluição 6 193 153 146 138 87 105 5 6 6 9 19 30 1:648 Diluição 5 184 129. 121 143 6 7 0 1 1 1 1 1 1:216 Diluição 4 180 145 22 24 2 3 3 1 1 0 0 0 1:72 Diluição 3 207 129. 1 0 2 2 1 0 4 1 0 1 01:24 Diluição 2 201 140 0 0 0 0 1 1 1 0 4 4 1:8 Diluição 1 Controle A Controle B Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Tabela 2: contagem de colônias bacterianas. CFU contagens são exportadas a partir do software bom para excel formato. Estas contagens podem ser organizadas em uma tabela mostrando que o bacteriano conta para todas as amostras duplicadas e controle de poços. Controle A Controle B 148 128 131 120 118 1:17496 Diluição 8 189 147 142 134 112 110 107 1:5832 Diluição 7 NSK (1-CtrB/CtrA): 22% 140 115 55 73 84 1:1944 Diluição 6 50% KI (CtrB/2): 73 142 96 6 8 25 1:648 Diluição 5 132 7 1 1 1 1:216 Diluição 4 23 3 2 1 0 1:72 Diluição 3 1 2 1 3 1 01:24 Diluição 2 0 0 1 1 4 1:8 Diluição 1 Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Tabela 3: cálculo do valor de corte de KI 50% e as médias da amostra duplicada. O valor de corte de KI 50% foi calculado tendo a média de todos os poços de controle B e dividindo por 2. As médias das duplicatas foram calculadas para cada diluição de cada amostra que foi executada em duplicado. Valor NSK também é calculado. Figura 4: esquema de interpolação linear. O número de bactérias sobreviventes (eixo y) em cada diluição do soro testado (eixo x) é plotada (diamantes negros), e pontos individuais são ligados pela linha preta fina, tracejada. As linhas horizontais contínuas e tracejadas indicam 0% e 50% de mortes, respectivamente. As diluições do soro acima (diluição 5) e abaixo (diluição 4) a 50%, matando a linha são conectados por uma linha vermelha, e concentração bactericida (KI) é indicada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. SBA KI Amostra 1 72 Amostra 2 216 Amostra 3 1994 Amostra 4 1994 Amostra 5 648 Tabela 4: SBA resultados apresentando concentração bactericida (KI). Valores de KI de SBA finais foram determinados para cada amostra e são mostrados. Esses valores são calculados usando os CFUs médias, o valor de corte de KI de 50% e a fórmula de interpolação linear.

Discussion

O protocolo descrito aqui demonstra um ensaio imunológico funcional para avaliar a atividade de shigellacidal de anticorpos no soro. No ensaio demonstrado por este protocolo os anticorpos monoclonais específicos para S. flexneri 3a foram usados9 juntamente com soros humanos controle de uma vacina de Shigella anterior estudo11. A origem do soro testado neste ensaio pode variar amplamente de amostras de animais pré-clínicos para amostras clínicas humanas, e a atividade shigellacidal da amostra soro será impactada pelo imunizações e exposições que o indivíduo tem experimentado. Alguns reactividade cruzada pode ser esperada entre serótipos estreitamente relacionados, especificamente, S. flexneri 2a e 3a S. flexneri mas pouca reactividade cruzada tem sido vista em destas tensões em comparação com a S. sonnei9. A base do SBA centra-se na ativação da cascata de complemento por ligação antígeno-anticorpo. Portanto, a manipulação do reagente BRC é um dos muitos passos críticos envolvidos na execução do presente protocolo. BRC foi selecionado para uso neste ensaio por causa de seu desempenho consistente e baixos níveis de NSK em outros ensaios bactericida12,13,14.  A atividade de BRC é sensível à temperatura e devem ser tomadas medidas adequadas para garantir que congelar descongelar ciclos são minimizadas, que o BRC é aliquotado em volumes de uso único, e que as alíquotas BRC são descongeladas rapidamente, imediatamente antes do uso no ensaio. A consistência da atividade complementar terá impacto sobre a reprodutibilidade deste teste. Outro passo crítico que a reprodutibilidade do ensaio de impacto é a produção e a diluição das populações bacterianas. É importante que antes de começar o ensaio a diluição adequada de estoques bacterianas é determinado, como o sucesso do ensaio é dependendo da produção consistente de controles A e B ter contagens CFU em média ~ 120 CFU por ponto. Para obter pontos que são contáveis pelo software, também é imperativo que a técnica utilizada para as bactérias da placa é executada com êxito. A deposição da solução bacteriana e inclinação da placa, para que os pontos executados ~ 2-3 cm é crítico para a produção de colônias da distribuição bem tamanho e correta para contagem exata pelo software legal. Dominar todas estas etapas irá garantir que os resultados precisos e consistentes são produzidos por este protocolo

Mesmo quando todos os passos críticos são executados bem pode ainda haver casos onde é necessário modificar ou solucionar este protocolo. Modificações do presente protocolo para avaliar outras bactérias podem exigir otimização da noite LBA placa temperatura de incubação, para assegurar a formação de microcolônias. Outras cepas de bactérias ou anticorpo fontes, além de soro, podem exigir a otimização da concentração do complemento. Valores NSK e KIs de soros de controlo também devem ser monitorizados para assegurar que o ensaio está funcionando adequadamente. NSK não deve subir mais 70%. O KI de controle soros não devem variar mais do que dizer ± 2SD. Para alcançar resultados consistentes e bem sucedidos ao usar este protocolo, será necessário executar todas as etapas conforme descrito aqui, com especial atenção para as etapas críticas descritas acima.

Enquanto este protocolo preenche uma necessidade importante da comunidade de pesquisa de Shigella , não é sem suas limitações. Este protocolo se baseia em materiais biológicos e, portanto, sempre haverá alguma variabilidade que é difícil de controlar. Variações na atividade de complemento de diferentes lotes e fontes podem contribuir para a variabilidade em ensaios. Para atenuar isso, é importante tratar adequadamente o complemento e testar novos lotes de complemento para a atividade antes da compra. Também pode ser útil criar pools de lotes de complemento com actividade conhecida para ter um fornecimento homogêneo. Este protocolo é simples pelo design e não requer qualquer equipamento especializado e a colônia automatizada enumerando software está disponível gratuitamente. Enquanto esta simplicidade é uma vantagem, permitindo que este protocolo deve ser usado em praticamente qualquer laboratório, ele ainda requer uma incubação durante a noite. Ensaios recentes têm sido descritos que tem muita exigência de incubação mais curta, mas que exigem especializada, preparação de reagentes15. Outra limitação deste teste é que, na sua forma atual ele só é capaz de investigar uma única espécie bacteriana, ao mesmo tempo. No campo de Shigella , há um desejo de criar uma vacina polivalente e ter testes imunológicos que podem avaliar a patógenos de forma multiplex é de grande valor. Este ensaio poderia ser modificado no futuro para atender a essa necessidade, mas na sua forma atual, é um ensaio de single-plex.

Enquanto este ensaio tem algumas limitações, ainda tem muitas vantagens sobre os métodos existentes ou alternativos. Estas vantagens incluem muitas melhorias que combinam para fazer a execução desse método, muito menos trabalhosa e mais elevado-throughput do que tradicional SBAs. O uso de populações bacterianas congelados, um formato de ensaio de placa de 96 poços, o chapeamento em pratos de petri quadrados maiores, a coloração das colônias que permite fotografar e colônia-contagem automática, todos ajudam a reduzir os materiais e o tempo necessário para completar este do ensaio. Este ensaio também tem vantagens sobre outros métodos de alta produtividade, porque não exige qualquer reagentes especializados ou equipamento. O protocolo descrito pode ser executado com reagentes básicos e gratuita de software, permitindo a sua aplicação em qualquer ambiente de laboratório.

Todas as vantagens que este protocolo fornece suporta o seu uso em muitas investigações futuras. O ensaio é ideal para o exame das respostas imunes após vacinação ou infecção natural. Esta aplicação permite a SBA ser uma ferramenta valiosa na pesquisa de vacina de Shigella e já foi utilizada para avaliar a imunogenicidade da vacina em vacinas de bio-conjugado de Shigella onde tem demonstrado a capacidade destas vacinas para induzi a produção de anticorpos funcionais16. Este protocolo foi testado extensivamente por vários laboratórios e foi mostrado para produzir resultados confiáveis e reprodutíveis9. Este protocolo também produz resultados comparáveis quando as mesmas amostras são testadas usando outros ensaios bactericida17. A consistência dos dados gerados por este ensaio, e sua compatibilidade com outros métodos mais antigos o torna uma ferramenta robusta para avaliar com precisão a actividade bactericida em amostras de soro. O ensaio também facilmente pode ser adaptado para avaliar os tipos de amostras adicionais. Enquanto o soro está prontamente disponível em ensaios clínicos adultos, pode ser difícil conseguir soro suficiente em ensaios com foco em bebés e crianças pequenas; uma das populações-alvo eventual para vacinas de Shigella . Nestes ensaios, sangue total é rotineiramente coletada em papel de filtro e secas. Tem havido algum sucesso preliminar com este tipo de formato de amostra usando a SBA. Além do sangue total, amostras da mucosa (tais como saliva, extratos de fezes e urina) são também um alvo que é relevante na pesquisa de vacina de Shigella . Atualmente, este protocolo foi avaliado por três dos serótipos mais clinicamente relevantes de Shigella , mas também pode ser adaptado para adicionais Shigella spp, bem como outros patógenos bacterianos. Futuro trabalho incidirá sobre a produção de um ensaio multiplex com muitas das mesmas características como o ensaio descrito por este protocolo. Um ensaio multiplexado permitirá avaliação de vários serótipos de Shigella simultaneamente, conservando mais volumes de amostra e as mãos na hora do ensaio. Há também um trabalho em andamento para transferir este ensaio para laboratórios em todo o globo. Estas avaliações globais irão gerar mais dados para a qualificação o ensaio em uma escala maior de pesquisa, e, ao mesmo tempo aumentar o número de laboratórios de Microbiologia e Imunologia que têm acesso a esta SBA avaliar bactérias e soro amostras coletadas de diferentes locais endêmicos. O ensaio descrito aqui é simples e de alto rendimento e tem a capacidade de melhorar a avaliação imunológica no campo de Shigella , bem como aplicações mais amplas para avaliação de outros patógenos bacterianos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por uma concessão do caminho de M.H.N. Este estudo foi conduzido como uma cooperativa de pesquisa e desenvolvimento de acordo entre o Walter Reed Army Institute de Research e da Universidade de Alabama em Birmingham.

Materials

Gelatin Sigma G9391 Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) Sigma T8877 ≥98.0% (HPLC)
Sodium azide (NaN3) Sigma S2002 ≥99.5%
Baby Rabbit Complement PelFreez 31061-3 3-4 week old
HBSS with Ca2+/Mg2+ Invitrogen 14065-56 Without Phenol Red
LB Agar (Lennox) Sigma L2897 Powder microbial growth medium
Bacto Agar BD 214010 Powdered, (C12H18O9)n
Glycerol Sigma G5516 For molecular biology, ≥99%
LB Broth (Lennox) Sigma L3022 Powder microbial growth medium
Square Petri Dish Sigma Z617679-240EA 120 mm x 120 mm
Assay Plate Costar 3799 96 well u-bottom plate with lid
NICE Software University of Alabama at Birmingham ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/
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References

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Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).
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