Een High-throughput Shigella-specifieke bactericide Assay

Dit protocol volgt de richtsnoeren van de WRAIR menselijke certificaathouder Protection Board. Monsters gebruikt in deze studie zijn menselijk serummonsters verzameld als onderdeel van WRAIR protocolnummer 1328, met inachtneming van alle institutionele en federale verordeningen betreffende de bescherming van proefpersonen. Monsters waren-geïdentificeerde, en het gebruik van deze anonieme monsters werd geclassificeerd als niet-menselijke onderwerp onderzoek door de UAB IRB (protocolnummer N150115001). 1. Prepareer Assay reagentia Bereiden van 1% gelatine door 1 gram gelatine toe te voegen tot 100 mL water. Autoclaaf en winkel bij kamertemperatuur. Bereiden van 100 mg/mL stockoplossing van TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) (1, 000 x) door toevoeging van 5 g van TTC aan 40 mL water. Wanneer de TTC volledig ontbonden is, stel het volume op 50 mL met water en een steriel filter met behulp van 0,2 µm filter. De oplossing bij 4 ° C bewaren en beschermen tegen licht.Opmerking: TTC afgescheurde de bacteriële kolonies en maakt ze veel makkelijker om te tellen. TTC oplossing heeft een lichte gele kleur. TTC oplossing ontwikkelt een rode kleur, negeren als vers bereiden. 10% natrium azide (NaN3) stockoplossing (100 x) voor te bereiden door 5 g NaN3 aan 40 mL water toe te voegen. Na volledige ontbinding, voeg water tot 50 mL. Bewaren bij kamertemperatuur.Let op: Natriumazide kan is een GIF en toxische indien gegeten of geabsorbeerd door de huid of ogen. Het kan reageren met lood en koperen sanitaire te vormen zeer explosieve metalen aziden. Inzake verwijdering van reagentia met natriumazide, spoelen met een groot volume van water te voorkomen azide opbouw of gooi in een zak van biohazard. LBA plaat (LB agarplaat) voor te bereiden door 35 g LB agar toe te voegen aan 1 liter water en autoclaaf. Voeg 25 mL toe aan elke vierkante petrischaal (120 x 120 mm2). Incubeer de platen bij RT voor 10-20 min om agar te stollen. Plaats platen terug in plastic zakken en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 1 maand. Overlay Agar bereid door 7,5 gram agar toe te voegen aan 1000 mL water en autoclaaf. Incubeer in waterbad 56 ° C totdat het nodig is. Vlak voor gebruik, voeg 1 mL 100 mg/mL TTC en 10 mL 10% NaN3 en meng goed.Opmerking: Elke LBA plaat moet 25 mL Overlay agar. Topagar kan worden bereid tot een maand op voorhand en gesmolten in een microgolf of op een hete plaat zo nodig voor de bepaling. Zorg ervoor dat agar temperatuur ~ 55 ° C vóór toepassing aan LBA platen. Bereiden Assay Buffer door toevoeging van 5 mL van de 10 x Hanks evenwichtig zout oplossing (HBSS) met Ca2 +/Mg2 + en 5 mL van de 1% gelatine aan 40 mL water. Bewaren bij kamertemperatuur. 2. voorbereiding van de aanvulling en richten van bacteriën Baby konijn bereiden aanvulling (BRC)Opmerking: Gedetailleerde criteria voor aanvulling veel selectie kan hier worden gevonden: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf Verkrijgen van bevroren BRC en ontdooien met stromend koud water. Fysiek Meng het BRC elke ~ 10-20 min tot volledig ontdooid. BRC niet onderworpen aan herhaalde bevriezen dooi cycli. Terwijl BRC is ontdooien, label 1,5 mL, 5mL en 15 mL centrifuge buizen. Plaats het label buizen op ijs vooraf afkoelen. Juiste volume van de hoeveelheid BRC de vooraf gekoelde centrifuge buizen (na vullen, onmiddellijk terug elke buis naar het ijs). Aliquots bij ≤-70 ° C bewaren in de vriezer.Opmerking: Ongeveer 1 m van de aanvulling is nodig voor elke bepaling plaat. Aanvulling aliquots zijn voor eenmalig gebruik en moeten aliquoted in volumes te assay lay-outs. Ontdooi een aliquoot gedeelte van het actieve BRC om te bereiden warmte-geïnactiveerd BRC. Een waterbad 56 ° C voor te bereiden. Nadat het BRC is volledig ontdooid, het overbrengen van het waterbad en incubeer gedurende 30 min. Na incubatie, warmte-geïnactiveerd BRC te verwijderen uit het waterbad en laat afkoelen op RT voor 10-15 min. Mix krachtig, en aliquoot ~ 150 µL 1,5 mL microcentrifuge buizen. Opslaan van aliquots bij ≤-10 ° C. Bereiden doel bacteriën voorraadOpmerking: De onderstaande procedure wordt gebruikt voor het bereiden van 48 aliquots van doel bacteriën materieel; Als er meer aliquots nodig zijn het protocol kan worden opgeschaald. Verwijderen de bacteriën master voorraad ampul uit de diepvries en schraap het bevroren bacteriële oppervlak om te verwijderen van een kleine hoeveelheid ijs uit de ampul op een bloed agarplaat. Onmiddellijk de master voorraad flacon terugkeren naar de vriezer. Strijk dit kleine hoeveelheid bacteriële voorraad op de bloed agarplaat en bedek met de deksel van de plaat. De plaat ondersteboven na een nacht bebroeden in 37 °C/5% CO2 incubator. ~ 10 geïsoleerde gladde kolonies overbrengen in een tube van 50 mL met 30 mL van de pond-Bouillon. Incubeer gedurende 3-5 uur bij 37 ° C met zacht schudden totdat de Bouillon cultuur een OD600 van ~0.6-0,7 heeft. Oogst de top 12,5 mL van de cultuur en de overdracht aan een verse 50 mL-buis. Centrifugeer de cultuur bij 15.000 x g gedurende 2 min met behulp van een tafelblad micro-centrifuge. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 25 mL 15% steriele glycerol-LB. Meng goed en afzien van 0,5 mL aliquots in steriele 1,5 mL micro centrifuge buizen (~ 48 buizen). Opslaan aliquots bij ≤-70 ° C in de vriezer. Bevestig de bacteriële identiteit met behulp van de agglutinatietest vóór gebruik. Bepaling van de optimale verdunningsfactor voor doel bacteriën voorraadOpmerking: Elke batch van het doel bacteriën voorraad moet worden getitreerd in assay voorwaarden kunt bepalen van de verdunning moet opleveren ~ 120 CFU/plek op LB platen. Krijg een microtiterplaat plaat (verdunning plaat) en voeg 135 µL van Assay Buffer goed 1A. Voeg 120 µL van Assay boter te putten 1B – 1H. Verwijderen van een flacon van bevroren doel bacteriën uit de vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur. Toevoegen 15ul voor ontdooide bacteriële voorraad goed 1A zodat een 10-fold verdunning van de bacteriële voorraad. Overbrengen 30 µL van bacteriële oplossing uit goed 1A en 1B voor het uitvoeren van een 5-fold seriële verdunning. Blijven 5-fold seriële verdunningen 1H goed voor een totaal van 8 verdunningen (1:10; 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250). Krijgen een ander microtiterplaat plaat (Assay plaat) en 20 µL van Assay Buffer al goed in de kolommen 1 en 2 in de Assay plaat toe te voegen. Pipetteer 10 µL van verdunde bacteriën uit elk putje in kolom 1 van de verdunning plaat in de overeenkomstige putjes in de kolommen 1 en 2 van de Assay-plaat. 10 µL van bacteriën wordt overgebracht van goed 1A van de verdunning plaat in goed 1A en 2A in de Assay plaat, enz. Ga verder met de test als beschreven in Serum bactericide Assay (SBA) hieronder voor het besturingselement een en Control B, stappen 3.6-3.12. Nadat de platen hebben zijn geïncubeerd op ijs, gebruiken een meerkanaalspipet met 8 Pipetteer tips spot 10 µL van de putten in kolom 1 op een bord LBA. Ook ter plaatse de putten uit kolom 2 op het bord LBA. Doorgaan met de bepaling zoals hieronder beschreven in stappen 3.14-4.6. Bepalen van de bacteriën verdunning die ~ 120 CFU/plek in Control B opbrengsten, deze verdunning wordt gebruikt in de test. 3. serum bactericide Assay (SBA) Opmerking: De hieronder beschreven procedure is voor één assay plaat, maar het aantal Assay platen kan worden verhoogd. Warmte-inactivering testopnames door drachtige monsters in een waterbad van 56 ° C gedurende 30 minuten.Opmerking: Monsters moeten warmte-geïnactiveerd voorafgaand aan de test te trekken elke aanvulling van de endogene activiteit. Dit kan worden gedaan vóór de bepaling en geïnactiveerd monsters kunnen opnieuw bevroren of opgeslagen bij 4 ° C tot getest. Krijgen een Assay-plaat en 20 µL van Assay Buffer toevoegen aan kolommen 1 tot en met 12 van rijen A tot en met G. toevoegen 20 µL van Assay Buffer naar kolommen 1 en 2 van rij H, Zie tabel 1. Laden 30 µL van elk monster, in tweevoud, rij H van de Assay-plaat. Bijvoorbeeld, afzien van 30 µL van monster 1 in putten 3 H en 4 H, en afzien van 30 µL van monster 2 in putten 5 H en 6 H, etc. 3-voudig seriële verdunningen van monsters met een meerkanaalspipet uitvoeren Verwijderen van 10 µ van het monster uit putten 3H – 12H en overdracht aan overeenkomstige putjes in rij G en meng het monster goed door omhoog en omlaag pipetteren 8 – 10 keer. Vervolgens Verwijder 10 µ uit putten 3G – 12G en overdracht aan overeenkomstige putjes in rij F en meng goed. Blijven deze seriële verdunningen tot en met rij A. Na het mengen van de putten in rij A, verwijder en verwerp 10 µl van putten 3A-12A zodat alle putjes 20 µl bevatten.Opmerking: Omdat 20 µL van de serum wordt gebruikt in een totale assay volume van 80 µL, is er een 4-fold extra verdunning in de test. Deze verdunning moet rekening worden gehouden bij de berekening van een SBA-titer door de verdunning van het serum met 4 te vermenigvuldigen. Bijvoorbeeld, als een startende verdunning 1:2 wordt gebruikt, is de werkelijke verdunning wordt getest 1:8. Verwijder één flacon van bevroren Target bacteriën materieel en ontdooien bij kamertemperatuur. Verdun de bacteriën in 20 mL Assay Buffer volgens de vooraf bepaalde optimale verdunningsfactor (deze verdunningsfactor werd bepaald in punt 2.3). Voeg 10 µL van verdunde bacteriën aan elk putje van de plaat van de bepaling met behulp van een meerkanaalspipet. Verwijder één flacon van bevroren BRC en één flacon van warmte-geïnactiveerd BRC, ontdooien bij kamertemperatuur met stromend koud water bevroren of plaats op de rooster van een biologische veiligheid kabinet met het blazen van lucht te snel ontdooien. Bereid een 20%-oplossing van warmte-geïnactiveerd BRC. Mix 100 µL van warmte-geïnactiveerd BRC met 400 µL van Assay Buffer. Breng 50 µL van deze 20% warmte-geïnactiveerd BRC-oplossing in alle putjes in kolom 1 (besturingselement een wells).Opmerking: Warmte-geïnactiveerd BRC wordt gebruikt als een besturingselement niet-specifieke doden (NSK) volgen in de bepaling. Bereid een 20%-oplossing van inheemse BRC. Meng 1 mL inheemse BRC met 4 mL Assay Buffer. Voeg 50 µL van dit mengsel toe aan alle putjes in kolommen 2 tot en met 12 (Control B en test sample wells).Opmerking: De uiteindelijke concentratie van BRC in het reactiemengsel is 12,5%. Kort Assay plaat Meng door zachtjes schudden voor 10-15 s op een plaat shaker of meng door pipetteren naar boven en beneden de 8 keer met behulp van een meerkanaalspipet. Zet de plaat Assay in de microbiologische incubator 37 ° C gedurende 2 uur (zonder schudden). Droge 2 LBA platen door het verwijderen van deksels en platen te plaatsen onder ogen zien in biologische veiligheidskast voor 40-60 min. Wanneer de 2 h incubatie voltooid is, verplaatst de Assay plaat nat ijs en incubeer gedurende 10-20 min om te stoppen met de reactie. Met behulp van een pipet 12-kanaals, meng de putten in rij H, en ter plaatse plaat 10 µL van het reactiemengsel op de bodem van een LBA-plaat. Onmiddellijk kantelen van de plaat en laat de plekken om uit te voeren voor ~1.5-2 cm. Herhaal deze procedure voor rij G, F en E, spotten ze boven de vorige rij op de plaat LBA. Rij E, F, G en H zijn bevlekt op een LBA plaat, en rij A, B, C en D zijn bevlekt op een tweede plaat van de LBA op dezelfde manier (Zie Figuur 1). Incubeer de platen van de LBA bij kamertemperatuur totdat de oplossing in de LBA platen (10-15 min) is geadsorbeerd. Zet de deksels op de LBA-platen en plaats de LBA-platen in de microbiologische incubator ondersteboven aan na een nacht bebroeden (~ 16-18 h). Incubeer S. flexneri 2a en 3a bij 29 ° C en incubeer S. sonnei is bij 26 ° C.Opmerking: Deze temperaturen opbrengst kleinere “micro-kolonies” met maten geschikt voor nauwkeurige tellen door een kolonie teller9. Na een incubatieperiode van overnachting, voeg 25 mL Overlay Agar (bij ~ 55 ° C) met 100 µg/mL TTC en 0,1% NaN3 aan elke plaat LBA. Incubeer de platen van de LBA bij 37 ° C gedurende 2 uur dat de overlevende bacteriën te ontwikkelen van rode kleur, Zie afbeelding 1 hieronder. Platen met behulp van een digitale camera te fotograferen en overzetten van beelden naar een computer waarop de NIST geïntegreerde kolonie opsommen Software (NICE) is geïnstalleerd, Zie Figuur 2.Opmerking: MOOI kolonie-tellen software is kosteloos beschikbaar. Materialen overzicht voor meer informatie en installatie-instructies. 4. graaf bacteriële kolonies Open mooi Software en input Operator naam, Experiment informatie en alle assay notities in de lege velden. Zodra deze gegevens is ingevoerd klikt u op de knop gedaan . Gefotografeerde platen importeren door te klikken op de knop openen en selecteren van de juiste bestanden van de computer. De assay parameters aanpassen door het aantal rijen 4 en het aantal kolommen tot en met 12. Pas de instelling van de achtergrond naar-3 sigma en de resolutie te laag. Zie Figuur 2. De regio’s van belang (ROIs) verplaatsen door klikken en slepen zodat elke ROI zich direct boven een monster plek. Ervoor zorgen dat alle bacteriële kolonies binnen de ROI met geen overlapping tussen de monsters. Zodra één plaat voltooid is, dubbelklikt u op de volgende plaat in de lijst van de afbeeldingen opgeslagen gegevens en pas de ROIs. Zie Figuur 2. Wanneer alle platen zijn gecorrigeerd, klikt u op de groene knop van de graaf , Zie Figuur 2 en figuur 3. Wanneer tellen is voltooid klikt u op de knop exporteren om de gegevens in.xls/.xlsx-indeling te exporteren. Een naam en sla het bestand.xls/.xlsx voor data-analyse. Ordenen gegevens geëxporteerd in een tabelindeling zodat graven zijn georganiseerd in een tabel vertegenwoordigen de bepaling van de 96-wells-plaat, Zie tabel 2. 5. berekening van de SBA Titer (KI) en niet-specifieke doden (NSK) Opmerking: SBA titer of doden index (KI) wordt gedefinieerd als de reciproque waarde van de serumverdunning dat 50% van de doelgroep bacteriën doodt. Bereken de 50% doden index (KI) cutoff waarde door gemiddeld de CFU van actieve aanvulling controleputjes (Control-B) en te delen door 2. Berekent de gemiddelde CFU voor elke verdunning van elk monster dat werd uitgevoerd in twee exemplaren, Zie tabel 3. Omdat een serumverdunning zal zelden precies deze 50% KI waarde opleveren, het kan worden geïnterpoleerd van twee opeenvolgende serum verdunningen, die doodt minder dan 50% en die meer dan 50 doodt %, Zie Figuur 4. De formule voor de berekening van de geïnterpoleerde SBA KI wordt hieronder weergegeven:Opmerking: De bactericide titer, of KI, kan ook worden automatisch berekend met Opsotiter software ontwikkeld door UAB. Op verzoek Opsotiter, contact opnemen met Dr. Moon Nahm of Mr. Rob Burton. Zie https://www.vaccine.uab.edu voor contact informatie. Het NSK-waarde berekenen door middel van 1 minus het gemiddelde van Control B gedeeld door het gemiddelde van controle A.