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Biochemistry

Analyse der Endocytic Aufnahme und retrograder Transport mit funktionalisierten Nanobodies in kultivierten Zellen mit dem Trans-Golgi-Netzwerk

Published: February 21, 2019
doi:
10.3791/59111
,
1Biozentrum,University of Basel

Summary

Retrograder Transport von Proteinen von der Zelloberfläche an die Golgi unbedingt Membran Homöostase. Hier beschreiben wir eine Methode um biochemisch Zelle Oberfläche-Golgi Transport von rekombinanten Proteinen mit funktionalisierten Nanobodies in HeLa-Zellen zu analysieren.

Abstract

Transport von Proteinen und Membranen von der Zelloberfläche, die Golgi und darüber hinaus ist wichtig für die Homöostase, Organell Identität und Physiologie. Um die retrograde Protein Verkehr zu untersuchen, haben wir vor kurzem eine vielseitige gemeinnützige-basierte Toolkit zu analysieren, Transport von der Zelloberfläche, die Golgi-Komplex, entweder von festen und live Cell imaging, mittels Elektronenmikroskopie oder biochemisch entwickelt. Wir entwickelten funktionalisierten Anti-grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Nanobodies – klein, Monomere, hohe Affinität Protein Bindemittel – die auf Zell-Linien mit dem Ausdruck Membranproteine von Interesse mit einer extrazellulären GFP glyko-angewendet werden können. Derivatisierte Nanobodies verpflichtet, die GFP-Reporter sind speziell verinnerlicht und Huckepack Sortierung Routen die Reporter transportiert. Nanobodies wurden funktionalisiert mit Fluorophore zu folgen retrograden Transport durch Fluoreszenz-Mikroskopie und Imaging mit Ascorbat-Peroxidase 2 (APEX2) zu untersuchen, die Ultrastrukturforschung Lokalisierung der Reporter-gemeinnützige komplexe von Elektron zu leben Mikroskopie und mit Tyrosin Sulfatierung (TS) Motive zur Kinetik der Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) Ankunft zu beurteilen. In diesem methodischen Artikel erläutern wir das allgemeine Verfahren um bakteriell auszudrücken und funktionalisierten Nanobodies zu reinigen. Wir veranschaulichen die starke Verwendung von unserem Tool mit mCherry und TS geändert Nanobodies, endocytic Aufnahme und TGN Ankunft der Ladung Proteine zu analysieren.

Introduction

Retrograde Verkehr von Proteinen und Lipiden von der Zelloberfläche an verschiedenen intrazellulären Kompartimenten ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase der Membran, Sekretion auszugleichen und Komponenten von Anterograde Transport Maschinen1 zu recyceln , 2. nach Internalisierung über Clathrin-abhängige oder -unabhängige Endozytose, Protein- und Lipid-Ladung zuerst früh bevölkern Endosomen aus, wo sie weitere sind entweder entlang der Endo-lysosomalen System recycelt, die Plasmamembran umgeleitet oder gezielt mit dem Trans-Golgi-Netzwerk (TGN). Recycling aus Endosomen und/oder der Zelloberfläche, die TGN ist Teil des funktionalen Zyklus einer Reihe von Anterograde transmembranen Fracht-Rezeptoren, wie z. B. die kationen-abhängige und kation-unabhängige Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren (CDMPR und CIMPR) liefern neu synthetisiert lysosomale Hydrolasen aus der TGN zu späten Endosomen und Lysosomen3,4,5, Sortilin und SorLA6,7und Wntless (WLS) Transport von Wnt-Liganden an die Zelloberfläche 8 , 9 , 10 , 11. andere Proteine, die zurück zu der TGN abgerufen werden TGN46 und seine Verwandten Isoformen12,13,14, SNAREs (lösliche N– Ethylmaleimide-Sensitive Fusion Faktor Anhaftung Rezeptoren) 15 , 16 , Amyloid-Precursor-Protein (APP)18,19, progressive Ankylose (ANK) Protein20, 17, Metal Transporter wie ATP7A/B oder DMT121,22, und transmembranen Verarbeitung von Enzymen einschließlich Carboxypeptidase D, Furin oder BACE123,24,25. Abgesehen von dieser körpereigene Proteine entführen Bakterien- und Pflanze Giftstoffe (z.B., Shiga und Cholera-Toxin Rizin und Ranker) retrograder Transport Maschinen, die ER für Retrotranslocation in der Zellflüssigkeit26,27zu erreichen, 28,29.

Um direkt retrograde Datenverkehr analysieren, haben wir zuvor entwickelt, eine gemeinnützige-basierte Toolkit zu beschriften und Ladung Proteine von der Zelloberfläche zum intrazellulären Kompartimenten30folgen. Nanobodies repräsentieren eine neue Familie von Protein-Bindemittel Homodimeric Heavy-Kette-nur Antikörper (HcAbs), die natürlicherweise in Kameliden und Cartilaginous Fische31,32abgeleitet. Sie bilden die Variable Heavy-Kette-Domäne (LHKW) der HcAbs und haben viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Antikörper (z. B. IgGs): sie sind Monomere, klein (~ 15 kDa), sehr löslich, frei von Disulfid-Bindungen, bakteriell ausgedrückt werden können und für ausgewählte hohe Affinität verbindlichen33,34,35,36. Um unsere gemeinnützige Tool vielseitig und breit anwendbar zu machen, haben wir funktionalisierten Anti-GFP Nanobodies Oberfläche-Label und Track Proteinen getaggt mit GFP in ihrer extrazellulären/lumenal Domain beschäftigt. Durch Funktionalisierung der Nanobodies mit mCherry, Ascorbat-Peroxidase 2 (APEX2)37oder Tyrosin Sulfatierung (TS) Sequenzen, retrograder Transport von Bonafide transmembranen Ladung Proteine analysiert werden kann, indem Sie entweder behoben und live Cell Imaging, von Elektronenmikroskopie, oder biochemisch. Da Tyrosin Sulfatierung vermittelt durch Tyrosylprotein Sulfotransferasen (TPST1 und TPST2) eine posttranslationale Modifikation nur auf das Trans-Golgi ist/TGN, können wir direkt studieren, Transport und die Kinetik der Proteine des Interesses von der Zelloberfläche dazu intrazelluläre Golgi Fach38,39,40.

In diesem Artikel Methoden beschreiben wir die einfache Herstellung von funktionalisierten Nanobodies (LHKW-2xTS, – APEX2, – mCherry und Derivate) eignet sich für vielfältige Anwendungen, retrograden Transport in Säugerzellen30zu analysieren. Wir konzentrieren uns hauptsächlich auf die Verwendung von TS Standort geändert gemeinnützige für Analyse der intrazellulären Verkehr von der Zelloberfläche in das Fach der Sulfatierung.

Protocol

(1) bakterielle Transformation mit funktionalisierten Nanobodies Hinweis: Dieses Protokoll wurde für den Ausdruck, Reinigung und Analyse von funktionalisierten Anti-GFP Nanobodies wie zuvor beschrieben30optimiert. Derivatisierung mit anderen Protein Moieties erfordern Änderung des standard-Protokoll. Auftauen von Chemocompetent Bakterien (~ 100 µL) geeignet für Protein-Expression (z. B. Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) Zellen) …

Representative Results

Um retrograde Protein Transport zu verschiedenen intrazellulären Destinationen zu untersuchen, haben wir vor kurzem etabliert, ein Anti-GFP gemeinnützige-basiertes Tool zum Beschriften und rekombinanten Fusionsproteinen aus der Zelle Oberfläche30folgen. Hier zeigen wir die bakterielle Produktion solcher Nanobodies derivatisiert und demonstrieren ihre Anwendung endocytic Aufnahme durch Fluoreszenz-Mikroskopie sowie Immunoblotting und deren Einsatz zur TGN Ankunft…

Discussion

Nanobodies repräsentieren eine neue Klasse von Protein Bindemittel Gerüsten mit viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Antikörper: sie sind klein, stabil, Monomere, kann ausgewählt werden, denn hohe Affinität und fehlende Disulfid33,35, Anleihen 44 , 45. sie dienen in einer Reihe von Anwendungen, wie z. B. in Zellkultursystemen und Organismen in der Entwicklungsbiologie…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von Grant 31003A-162643 durch den Schweizerischen Nationalfonds unterstützt. Wir danken Nicole Beuret und das Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) für die Unterstützung.

Materials

Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1 x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50 x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100 x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35-mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M
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References

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Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).
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