Trasporto retrogrado delle proteine di superficie delle cellule di Golgi è essenziale per mantenere l’omeostasi della membrana. Qui, descriviamo un metodo per analizzare biochimicamente trasporti di superficie–Golgi cellulare di proteine ricombinanti utilizzando nanobodies funzionalizzati in cellule HeLa.
Trasporto di proteine e membrane dalla superficie delle cellule di Golgi e oltre è essenziale per l’omeostasi, organello identità e fisiologia. Per studiare il traffico della proteina retrograda, abbiamo recentemente sviluppato un versatile basato su nanobody toolkit per analizzare il trasporto dalla superficie delle cellule al complesso di Golgi, mediante imaging cellulare fisso e dal vivo, da microscopia elettronica, o biochimicamente. Abbiamo progettato funzionalizzati anti-verde proteina fluorescente (GFP) nanobodies — raccoglitori di proteine ad alta affinità, monomerico e piccoli — che possono essere applicati alle linee cellulari che esprimono le proteine di membrana di interesse con una parte extracellulare di GFP. Derivatizzato nanobodies associato ai reporter GFP sono specificamente interiorizzato e trasportato sulle spalle lungo rotte ordinamento il reporter. Nanobodies sono stati funzionalizzati con fluorofori seguire trasporto retrogrado mediante microscopia a fluorescenza e immagini, con ascorbato perossidasi 2 (APEX2) per studiare la localizzazione ultrastrutturale dei reporter-nanobody complessi da elettrone dal vivo microscopia e con motivi di solfatazione (TS) di tirosina per valutare la cinetica dell’arrivo di trans-Golgi network (TGN). In questo articolo metodologico, descriviamo la procedura generale per batterico esprimere e purificare nanobodies funzionalizzati. Vi illustriamo l’uso potente del nostro strumento utilizzando il nanobodies mCherry – e TS-modificato per analizzare l’assorbimento endocitosi e TGN arrivo di proteine cargo.
Retrogrado traffico di proteine e di lipidi dalla superficie delle cellule ai vari compartimenti intracellulari è cruciale per il mantenimento dell’omeostasi di membrana per controbilanciare la secrezione e riciclare componenti di anterograda trasporto macchinari1 , 2. a seguito di internalizzazione tramite endocitosi clatrina-dipendente o – indipendente, carico della proteina e del lipido innanzitutto popolare presto endosomes da dove si trovano ulteriori reindirizzamento sia lungo il sistema endolisosomiale, riciclato alla membrana plasmatica, o mirati alla rete trans-Golgi (TGN). Riciclaggio da endosomi e/o di superficie delle cellule a livello di TGN è parte del ciclo funzionale di un numero di recettori transmembrana carico anterograda, quali i recettori di mannosio-6-fosfato catione-dipendenti e indipendenti del catione (CDMPR e CIMPR) consegna recentemente sintetizzato idrolasi lisosomiale da TGN tardi endosomi e lisosomi3,4,5, sortilina e SorLA6,7e Wntless (WLS) trasporto di ligandi di Wnt alla superficie delle cellule 8 , 9 , 10 , 11. altre proteine Estratto torna a TGN sono TGN46 e sue isoforme correlate12,13,14, Rullanti ( N– ethylmaleimide-sensibili fusione fattore allegato recettori solubili) 15 , 16 , 17, precursore dell’amiloide (APP) di proteina18,19, anchilosi progressiva (ANK) proteina20, trasportatori metallici quali ATP7A/B o DMT121,22e del transmembrane elaborazione enzimi tra cui carbossipeptidasi D, furin o BACE123,24,25. Oltre a queste proteine endogene, tossine batteriche e pianta (ad es., tossina Shiga e colera, ricina e abrina) dirottare macchinari di trasporto retrogrado per raggiungere il pronto soccorso per dislocazione nel cytosol26,27, 28,29.
Al fine di analizzare direttamente il traffico retrograda, precedentemente abbiamo sviluppato un kit di strumenti basati su nanobody per etichettare e seguire le proteine cargo dalla superficie delle cellule per compartimenti intracellulari30. Nanobodies rappresentano una nuova famiglia di proteine leganti derivati da omodimeriche pesante-catena-solo gli anticorpi (hcAbs) che si presentano naturalmente in camelidi e pesci cartilaginei31,32. Essi costituiscono il dominio variabile di catene pesanti (VHH) di hcAbs e presentano molti vantaggi sopra gli anticorpi convenzionali (ad es., IgG): sono monomerici, piccolo (~ 15 kDa), altamente solubile, privo di legami bisolfurico, può essere espresso batterico e selezionato per legame ad alta affinità33,34,35,36. Per rendere il nostro strumento di nanobody versatile e ampiamente applicabili, abbiamo impiegato nanobodies funzionalizzati anti-GFP per le proteine di superficie-etichetta e pista con GFP al loro dominio extracellulare/lumenal etichettate. Dalla funzionalizzazione di nanobodies con mCherry, ascorbato perossidasi 2 (APEX2) trasporto retrogrado37, o sequenze di solfatazione (TS) tirosina di proteine transmembrana carico bonafide può essere analizzato da uno fisso e live imaging cellulare, di la microscopia elettronica, o biochimicamente. Poiché la solfatazione di tirosina mediata da tyrosylprotein sulfotransferasi (TPST1 e TPST2) è una modificazione post traduzionale limitato a trans-Golgi/TGN, possiamo studiare direttamente trasporti e cinetica di proteine di interesse dalla superficie delle cellule a questo intracellulare Golgi vano38,39,40.
In questo articolo di metodi, descriviamo la facilità di produzione di nanobodies funzionalizzati (VHH-2xTS, – APEX2, – mCherry e derivati), adatto per un numero di applicazioni per analizzare il trasporto retrogrado in cellule di mammifero30. Ci concentriamo principalmente sull’uso di TS per volta il sito nanobody per l’analisi del traffico intracellulare dalla superficie delle cellule al comparto della solfatazione.
Nanobodies rappresentano una classe emergente di proteina legante ponteggi con molti vantaggi rispetto ai convenzionali anticorpi: sono piccole, stabile, monomerico, possono essere selezionati per legami disolfuro ad alta affinità e mancanza33,35, 44 , 45. sono utilizzati in numerose applicazioni, come nei sistemi di coltura delle cellule e negli organismi in biologia dello sviluppo<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da Grant 31003A-162643 di Swiss National Science Foundation. Ringraziamo Nicole Beuret e Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) per il supporto.
Anti-GFP antibody | Sigma-Aldrich | 118144600001 | Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche |
Anti-His6 antibody | Bethyl Laboratories | A190-114A | |
Anti-actin antibody | EMD Millipore | MAB1501 | |
Goat anti-rabbit HRP | Sigma-Aldrich | A-0545 | |
Goat anti-mouse HRP | Sigma-Aldrich | A-0168 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | dissolved in 1 x PBS/1%BSA |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A3672 | |
D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO |
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride | Sigma-Aldrich | A3785 | dissolved in sterile water |
DNase I | Applichem | A3778 | dissolved in sterile water |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | 18037059001 | Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche |
Brefeldin A (BFA) | Sigma-Aldrich | B5936 | |
Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
Penicillin/Streptomycin | Bioconcept | 4-01F00-H | |
L-glutamine | Applichem | A3704 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biowest | S181B-500 | |
Sulfur-35 as sodium sulfate | Hartmann Analytics | ARS0105 | Product contains 5 mCi |
Earle's balanced salts | Sigma-Aldrich | E6267 | |
MEM amino acids (50 x) solution | Sigma-Aldrich | M5550 | |
MEM vitamin solution (100 x) | Sigma-Aldrich | M6895 | |
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836153001 | Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche |
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Applichem | A1008 | dissolved in sterile water, stock is 1 M |
Carbenicillin disodium salt | Applichem | A1491 | dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL |
Kanamycin sulfate | Applichem | A1493 | dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL |
Coomassie-R (Brilliant Blue) | Sigma-Aldrich | B-0149 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Applichem | A3813 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Ni Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5268-01 | |
His GraviTrap columns | GE Healthcare | GE11-0033-99 | |
His buffer kit | GE Healthcare | GE11-0034-00 | |
Disposable PD10 desalting columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well | Bio-Rad | 456-1096 | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537 | |
35-mm dishes | Falcon | 353001 | |
6-well plates | TPP | 92406 | |
Glass coverslips (No. 1.5H) | VWR | 631-0153 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Applichem | A0999.0025 | dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM |
Tryptone | Applichem | A1553 | |
Yeast extract | Applichem | A1552 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 105833 | dissolved in sterile water, stock is 1 M |
Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 102382 | dissolved in sterile water, stock is 1 M |
Sodium chloride | Merck Millipore | 106404 | dissolved in sterile water, stock is 5 M |