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Biochemistry

Análisis de absorción endocíticas y transporte retrógrado a la red Trans-Golgi en células cultivadas de Nanobodies funcionalizados

Published: February 21, 2019
doi:
10.3791/59111
,
1Biozentrum,University of Basel

Summary

Transporte retrógrado de proteínas de la superficie de la célula al Golgi es esencial para mantener la homeostasis de la membrana. Aquí, describimos un método para analizar bioquímicamente transporte de superficie de Golgi de la célula de proteínas recombinantes utilizando nanobodies funcionalizados en células HeLa.

Abstract

Transporte de proteínas y membranas de la superficie celular hasta el Golgi y más allá es esencial para la homeostasis, la identidad de organelas y la fisiología. Para estudiar el tráfico de proteína retrógrada, recientemente hemos desarrollado herramientas basadas en nanobody versátil para analizar el transporte de la superficie celular para el aparato de Golgi, ya sea por proyección de imagen fija y vivo de la célula, por microscopia electrónica o bioquímico. Hemos diseñado nanobodies funcionalizados anti-verde proteína fluorescente (GFP), carpetas pequeñas, monoméricas, de alta afinidad de la proteína, que puede ser aplicado a líneas celulares de expresión de proteínas de membrana de interés con una parte extracelular de la GFP. Derivatizados nanobodies a los reporteros GFP específicamente se internalizan y transportado piggyback a lo largo de vías de clasificación de los reporteros. Nanobodies fueron funcionalizados con fluoróforos transporte retrógrado por microscopía de fluorescencia y proyección de imagen, con ascorbato peroxidasa 2 (APEX2) para investigar la localización ultraestructural del reportero nanobody complejos de electrónica en vivo microscopia y con motivos de tirosina sulfatación (TS) para evaluar la cinética de la llegada de trans-Golgi network (TGN). En este artículo metodológico, describiremos el procedimiento general para expresar y purificar nanobodies funcionalizados para bacteriano. Ilustramos el uso poderoso de nuestra herramienta usando los nanobodies mCherry y TS modificado para analizar endocíticas absorción y llegada del TGN de proteínas de carga.

Introduction

Tráfico retrógrado de proteínas y lípidos de la superficie celular en varios compartimientos intracelulares es crucial para el mantenimiento de la homeostasis de la membrana para contrarrestar la secreción y reciclaje de componentes de maquinarias de transporte anterograde1 , 2. después de internalización vía endocytosis clathrin-dependiente – independiente o, carga de proteína y lípidos en primer lugar rellenar temprano endosomas desde donde son más bien a lo largo del sistema endo-lisosomales, reciclado a la membrana plasmática, Redirigido o dirigidas a la red trans-Golgi (TGN). Reciclaje de endosomas y la superficie de la célula al TGN es parte del ciclo funcional de una serie de receptores de transmembrana carga anterógrada, tales como los receptores de manosa-6-fosfato catión-dependiente y la independiente del catión (CDMPR y CIMPR) entrega recién sintetizado lisosomales hidrolasas desde el TGN para fines endosomas y lisosomas3,4,5, sortilina, SorLA6,7y Wntless (WLS) transporte de ligandos Wnt a la superficie de la célula 8 , 9 , 10 , 11. otras proteínas obtenidos al TGN son TGN46 y sus isoformas relacionadas12,13,14, trampas ( N– etilmaleimida sensible fusión factor accesorio receptores solubles) 15 , 16 , precursora del amiloide (APP) de la proteína18,19, anquilosis progresiva (ANK) proteína20, 17, transportadores metálicos como ATP7A/B o DMT121,22y transmembrana procesamiento de las enzimas como la carboxipeptidasa D, furin o BACE123,24,25. Aparte de estas proteínas endógenas, toxinas bacterianas y vegetales (por ejemplo, la toxina Shiga y el cólera, ricina y abrina) secuestran maquinarias transporte retrógrado para llegar a la sala de emergencia para retrotranslocation en el citosol26,27, 28,29.

Para analizar directamente tráfico retrógrado, previamente hemos desarrollado un conjunto de herramientas basadas en nanobody etiqueta y seguir las proteínas de carga de la superficie de la célula a compartimientos intracelulares30. Nanobodies representan una nueva familia de proteínas ligantes derivados homodiméricas pesada cadena-sólo anticuerpos (hcAbs) que ocurren naturalmente en camélidos y peces cartilaginosos31,32. Constituyen el dominio variable de cadena pesada (VHH) de hcAbs y tienen muchas ventajas sobre anticuerpos convencionales (por ejemplo, IgGs): son monoméricas, pequeño (~ 15 kDa), altamente soluble, desprovisto de disulfuro, puede ser bacteriano expresada y seleccionado para alta afinidad de Unión33,34,35,36. Para que nuestra herramienta nanobody versátil y ampliamente aplicables, empleamos funcionalizados anti-GFP nanobodies para etiqueta de superficie y pista proteínas etiquetadas con GFP en su dominio extracelular/lumenal. Funcionalización de nanobodies con mCherry, ascorbato peroxidasa 2 (APEX2) transporte retrógrado37, o secuencias de sulfatación (TS) de tirosina de las proteínas de transmembrana carga bonafide puede ser analizado ya sea fijo y vive la proyección de imagen de la célula, por microscopia electrónica, o bioquímico. Ya que la sulfatación de la tirosina mediado por Sulfotransferasas tyrosylprotein (TPST1 y TPST2) es una modificación postraduccional restringida para el trans-Golgi/TGN, directamente podemos estudiar transporte y cinética de las proteínas de interés de la superficie celular para esto 38,compartimiento de intracelular Golgi del39,40.

En este artículo de métodos, nos describe la facilidad de producción de nanobodies funcionalizados (VHH-2xTS, – APEX2, – mCherry y derivados) para una serie de aplicaciones para analizar el transporte retrógrado en células de mamíferos30. Nos centramos principalmente en el uso de TS nanobody sitio modificado para el análisis del tráfico intracelular de la superficie celular del compartimiento de sulfatación.

Protocol

1. bacteriana transformación con Nanobodies funcionalizados Nota: Este protocolo ha sido optimizado para la expresión, purificación y análisis de nanobodies funcionalizados anti-GFP como se describió anteriormente30. Derivatización con otras moléculas de proteína puede requerir modificación de este protocolo estándar. Descongelar las bacterias chemocompetent (~ 100 μL) adecuadas para la expresión de la proteína (p. ej., Escher…

Representative Results

Para investigar el transporte retrógrado de la proteína a diferentes destinos intracelulares, recientemente hemos establecido una anti-GFP nanobody-herramienta para la etiqueta y siga las proteínas recombinantes de fusión de la superficie de la célula30. Aquí, demostramos la producción bacteriana de tal derivatizada nanobodies y demostrar su aplicación al estudio de absorción endocíticas por microscopía de fluorescencia y immunoblotting, así como su uso…

Discussion

Nanobodies representan una clase emergente de andamios de proteína ligante con muchas ventajas sobre anticuerpos convencionales: son pequeños, estables, monoméricas, puede seleccionarse para bonos de alta afinidad y falta disulfuro33,35, 44 , 45. se utilizan en un número de aplicaciones, tales como en sistemas de cultivo de células y organismos en el desarrollo de la biología<sup class="x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por Grant 31003A-162643 por la Swiss National Science Foundation. Agradecemos a Nicole Beuret y el Biozentrum instalación del núcleo de la proyección de imagen (IMCF) para apoyo.

Materials

Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1 x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50 x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100 x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35-mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M
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References

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Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).
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