JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

تحليل لامتصاص اندوسيتيك والنقل إلى الوراء إلى غولجي عبر الشبكة باستخدام نانوبوديس فونكتيوناليزيد في الخلايا المستزرعة

Published: February 21, 2019
doi:
10.3791/59111
,
1Biozentrum,University of Basel

Summary

النقل إلى الوراء من البروتينات من سطح الخلية إلى غولجي أمر ضروري للحفاظ على التوازن الغشاء. هنا، نحن تصف طريقة لتحليل الخلايا السطحية غولجي النقل المؤتلف البروتينات باستخدام نانوبوديس فونكتيوناليزيد في خلايا هيلا المتحلل.

Abstract

النقل من البروتينات والأغشية من سطح الخلية غولجي وما بعدها ضروري للتوازن والهوية عضية وعلم وظائف الأعضاء. لدراسة حركة تراجعية البروتين، وضعنا مؤخرا مجموعة من أدوات المستندة إلى نانوبودي تنوعاً لتحليل النقل من سطح الخلية إلى المجمع غولجي، أما عن طريق خلية ثابتة ويعيش التصوير، بالمجهر الإلكتروني، أو كيميائيا. نحن هندسيا nanobodies نيون فونكتيوناليزيد الأخضر المضادة البروتين (التجارة والنقل) – موثقات الصغيرة، أحادي، والنسب العالية من البروتين – التي يمكن تطبيقها على خطوط الخلايا معربا عن بروتينات الغشاء من الاهتمام مع مجموعة بروتينات فلورية خضراء خارج الخلية. ديريفاتيزيد nanobodies منضمة إلى الصحفيين بروتينات فلورية خضراء يتم استيعابه على وجه التحديد وتنقل تراكبيا على طول طرق الفرز الصحفيين. كانت فونكتيوناليزيد نانوبوديس مع fluorophores تتبع النقل إلى الوراء بالفحص المجهري الأسفار والعيش التصوير، مع اسكوربات البيروكسيديز 2 (APEX2) للتحقيق في توطين مجمعات مراسل-نانوبودي ultrastructural إلكترون الفحص المجهري، ومع زخارف تيروزين الكبرتة (TS) لتقييم حركية ترانس-غولجي وصول الشبكة (TGN). في هذه المقالة المنهجية، نحن مخطط الإجراء العام للتعبير عن البكتريا وتطهير نانوبوديس فونكتيوناليزيد. نحن لتوضيح استخدام أداة لدينا استخدام nanobodies تعديل مشري والملخص لتحليل TGN وصول البضائع البروتينات وامتصاص اندوسيتيك قوية.

Introduction

حركة تراجعية من البروتينات والدهون من سطح الخلية إلى مختلف الأقسام داخل الخلايا أمر حاسم للحفاظ على التوازن غشاء على موازنة إفراز وإعادة تدوير مكونات الأجهزة النقل anterograde1 , 2. بعد الاستيعاب الداخلي عن طريق الالتقام تعتمد على كلاثرين أو-مستقلة، البروتين والدهن الشحن أولاً ملء المبكر اندوسوميس من أين هم كذلك توجيه أما على طول النظام إندو-الليزوزومية، وإعادة تدويرها لغشاء البلازما، أو الموجهة إلى شبكة ترانس-غولجي (TGN). إعادة التدوير من اندوسوميس و/أو سطح الخلية TGN جزء من دورة الوظيفي عدد من مستقبلات البضائع transmembrane anterograde، مثل مستقبلات يطلق – 6-فوسفات تعتمد على الأيونات الموجبة والايونات الموجبة المستقلة (كدمبر وسيمبر) تسليم حديثا توليفها hydrolases الليزوزومية من TGN أواخر اندوسوميس وليسوسوميس3،،من45، سورتيلين وسورلا6،7ونتليس (ولس) نقل يغاندس Wnt إلى سطح الخلية 8 , 9 , 10 , 11-هي البروتينات الأخرى تم استردادها مرة أخرى إلى TGN TGN46 وفي إيسوفورمس ذات الصلة12،13،14، الافخاخ (القابلة للذوبان N-اثيلماليميدي-تراعي الانصهار عامل مرفق مستقبلات) 15 , 16 , 17، قسط التدريجي (عنك) البروتين20الناقلين المعادن مثل ATP7A/B أو DMT121،22، و transmembrane، اميلويد السلائف البروتين (APP)18،19 تجهيز الإنزيمات بما في ذلك كاربوكسيبيبتيداسي د، فارين أو BACE123،،من2425. وبصرف النظر عن هذه البروتينات الذاتية، خطف السموم البكتيرية والنبات (مثل السمية شيغا، والكوليرا، ومادة الريسين وابرين) الآليات النقل إلى الوراء للوصول إلى لائحة ريتروترانسلوكيشن في سيتوسول26،27، ،من 2829.

من أجل مباشرة تحليل حركة المرور إلى الوراء، قد سبق أن وضعت مجموعة من أدوات المستندة إلى نانوبودي لوسم وتتبع الشحنات البروتينات من سطح الخلية إلى المقصورات داخل الخلايا30. نانوبوديس تمثل أسرة جديدة من موثقات البروتينات المشتقة من هوموديميريك الثقيلة-سلسلة–فقط الأجسام المضادة (هكابس) التي تحدث طبيعيا في31،الإبليات والأسماك الغضروفية32. أنها تشكل المجال الثقيلة-سلسلة متغير (فة) من هكابس ولها العديد من المزايا على الأجسام المضادة التقليدية (مثلاً، إيجس): أحادي، الصغيرة (كاتشين ~ 15)، القابلة للذوبان العالية، تخلو من ثنائي كبريتيد السندات، يمكن أعرب البكتريا، والمحدد ل ربط عالية تقارب33،34،،من3536. لجعل أداة نانوبودي لدينا تنوعاً وقابلة للتطبيق على نطاق واسع، استخدمنا نانوبوديس مكافحة فونكتيوناليزيد-التجارة والنقل للبروتينات السطحية-التسمية والمسار معلم مع التجارة والنقل في مجال اختصاصهم خارج الخلية/لومينال. الروغان نانوبوديس مع متشيري، اسكوربات البيروكسيديز 2 (APEX2) النقل إلى الوراء37، أو تسلسل تيروزين الكبرتة (TS)، أصيل البضائع transmembrane البروتينات يمكن تحليلها من قبل أما ثابتة ويعيش تصوير الخلية، التي المجهر الإلكتروني، أو كيميائيا. منذ الكبرتة تيروزين توسط سولفوترانسفيراسيس تيروسيلبروتين (TPST1 و TPST2) تعديل بوسترانسلاشونال مقيد إلى ترانس-غولجي/TGN, نحن يمكن مباشرة دراسة النقل وحركية من البروتينات للفائدة من سطح الخلية إلى هذا داخل الخلايا غولجي حجرة38،،من3940.

في هذه المقالة الأساليب، يصف لنا السهولة لإنتاج نانوبوديس فونكتيوناليزيد (فة-2xTS-APEX2،-مشري ومشتقاتها) مناسبة لعدد من التطبيقات لتحليل النقل إلى الوراء في خلايا الثدييات30. نحن تركز أساسا على استخدام الملخص تعديل موقع نانوبودي لتحليل حركة المرور داخل الخلايا من سطح الخلية حجرة الكبرتة.

Protocol

1-البكتيرية التحول مع نانوبوديس فونكتيوناليزيد ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول للتعبير، وتنقية، وتحليل لمكافحة فونكتيوناليزيد-التجارة والنقل نانوبوديس كما هو موضح سابقا30. Derivatization مع مويتيس البروتين الأخرى قد تحتاج إلى تعديل هذا البروتوكول القياسي.</p…

Representative Results

للتحقيق في نقل البروتين إلى الوراء إلى مختلف الوجهات داخل الخلايا، أنشأنا مؤخرا أداة تستند إلى نانوبودي المضادة-التجارة والنقل لوسم وتتبع البروتينات الانصهار المؤتلف من سطح الخلية30. وهنا نبدي إنتاج البكتيرية مثل ديريفاتيزيد نانوبوديس، وتبرهن على تطبيقها …

Discussion

نانوبوديس تمثل طبقة ناشئة من البروتين السقالات الموثق بالعديد من المزايا على الأجسام المضادة التقليدية: فهي صغيرة، ومستقرة، وأحادي, ويمكن تحديدها لسندات عالية من ثنائي كبريتيد تقارب والافتقار إلى3533،، 44 , 45-وهي تستخدم …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل 31003A-162643 منحة من “مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية”. ونحن نشكر بورت نيكول وبيوزينتروم التصوير الأساسية مرفق (إيمكف) للدعم.

Materials

Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1 x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50 x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100 x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35-mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. 106 (3), 617-628 (1988).
  4. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 4 (3), 202-212 (2003).
  5. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  6. Pallesen, L. T., Vaegter, C. B. Sortilin and SorLA regulate neuronal sorting of trophic and dementia-linked proteins. Molecular Neurobiology. 45 (2), 379-387 (2012).
  7. Gustafsen, C., et al. Sortilin and SorLA display distinct roles in processing and trafficking of amyloid precursor protein. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (1), 64-71 (2013).
  8. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Developmental Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  9. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nature Cell Biology. 13 (8), 914-923 (2011).
  10. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nature Cell Biology. 10 (2), 178-185 (2008).
  11. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nature Communications. 9 (1), 3737 (2018).
  12. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochimica et Biophysica Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  13. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. Journal of Cell Science. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  14. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. The Journal of Cell Biology. 125 (2), 253-268 (1994).
  15. Mallard, F., et al. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. The Journal of Cell Biology. 156 (4), 653-664 (2002).
  16. Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Molecular Biology of the Cell. 11 (1), 23-38 (2000).
  17. Hirst, J., et al. Distinct and overlapping roles for AP-1 and GGAs revealed by the "knocksideways" system. Current biology. 22 (18), 1711-1716 (2012).
  18. Burgos, P. V., et al. Sorting of the Alzheimer’s disease amyloid precursor protein mediated by the AP-4 complex. Developmental Cell. 18 (3), 425-436 (2010).
  19. Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans-Golgi network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 109 (30), E2077-E2082 (2012).
  20. Seifert, W., et al. The progressive ankylosis protein ANK facilitates clathrin- and adaptor-mediated membrane traffic at the trans-Golgi network-to-endosome interface. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3836-3848 (2016).
  21. Tabuchi, M., Yanatori, I., Kawai, Y., Kishi, F. Retromer-mediated direct sorting is required for proper endosomal recycling of the mammalian iron transporter DMT1. Journal of Cell Science. 123 (Pt 5), 756-766 (2010).
  22. La Fontaine, S., Mercer, J. F. Trafficking of the copper-ATPases, ATP7A and ATP7B: role in copper homeostasis. Archives of Biochemistry and Biophysics. 463 (2), 149-167 (2007).
  23. Burd, C. G. Physiology and pathology of endosome-to-Golgi retrograde sorting. Traffic. 12 (8), 948-955 (2011).
  24. Chia, P. Z., Gasnereau, I., Lieu, Z. Z., Gleeson, P. A. Rab9-dependent retrograde transport and endosomal sorting of the endopeptidase furin. Journal of Cell Science. 124 (Pt 14), 2401-2413 (2011).
  25. Wahle, T., et al. GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network. Molecular and Cellular Neurosciences. 29 (3), 453-461 (2005).
  26. Johannes, L., Goud, B. Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum. Trends in Cell Biology. 8 (4), 158-162 (1998).
  27. van Deurs, B., Tonnessen, T. I., Petersen, O. W., Sandvig, K., Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. Journal of Cell Biology. 102 (1), 37-47 (1986).
  28. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 18, 1-24 (2002).
  29. Sandvig, K., et al. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358 (6386), 510-512 (1992).
  30. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  31. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  32. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  33. Bieli, D., et al. Development and Application of Functionalized Protein Binders in Multicellular Organisms. International Review of Cell and Molecular Biology. 325, 181-213 (2016).
  34. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  35. Helma, J., Cardoso, M. C., Muyldermans, S., Leonhardt, H. Nanobodies and recombinant binders in cell biology. Journal of Cell Biology. 209 (5), 633-644 (2015).
  36. Harmansa, S., Affolter, M. Protein binders and their applications in developmental biology. Development. 145 (2), (2018).
  37. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  38. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annual Review of Physiology. 50, 363-376 (1988).
  39. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. The Journal of Cell Biology. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  40. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotechnology. 25 (5), 299-317 (2009).
  41. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. The Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  42. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. Journal of Cell Biology. 100 (3), 826-834 (1985).
  43. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  44. Kaiser, P. D., Maier, J., Traenkle, B., Emele, F., Rothbauer, U. Recent progress in generating intracellular functional antibody fragments to target and trace cellular components in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (11), 1933-1942 (2014).
  45. Dmitriev, O. Y., Lutsenko, S., Muyldermans, S. Nanobodies as Probes for Protein Dynamics in Vitro and in Cells. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3767-3775 (2016).
  46. Harmansa, S., Hamaratoglu, F., Affolter, M., Caussinus, E. Dpp spreading is required for medial but not for lateral wing disc growth. Nature. 527 (7578), 317-322 (2015).
  47. Harmansa, S., Alborelli, I., Bieli, D., Caussinus, E., Affolter, M. A nanobody-based toolset to investigate the role of protein localization and dispersal in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  48. Caussinus, E., Kanca, O., Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (1), 117-121 (2012).
  49. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  50. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  51. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 567-572 (2011).
  52. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  53. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, (2018).
  54. De Genst, E., et al. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 103 (12), 4586-4591 (2006).
  55. Truttmann, M. C., et al. HypE-specific nanobodies as tools to modulate HypE-mediated target AMPylation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9087-9100 (2015).
  56. Ashour, J., et al. Intracellular expression of camelid single-domain antibodies specific for influenza virus nucleoprotein uncovers distinct features of its nuclear localization. Journal of Virology. 89 (5), 2792-2800 (2015).
  57. Yamagata, M., Sanes, J. R. Reporter-nanobody fusions (RANbodies) as versatile, small, sensitive immunohistochemical reagents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (9), 2126-2131 (2018).
  58. Pleiner, T., Bates, M., Gorlich, D. A toolbox of anti-mouse and anti-rabbit IgG secondary nanobodies. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1143-1154 (2018).
  59. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nature Methods. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  60. Robinson, M. S., Sahlender, D. A., Foster, S. D. Rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. Developmental Cell. 18 (2), 324-331 (2010).
  61. Meyer, C., et al. mu1A-adaptin-deficient mice: lethality, loss of AP-1 binding and rerouting of mannose 6-phosphate receptors. The EMBO Journal. 19 (10), 2193-2203 (2000).
  62. Utskarpen, A., Slagsvold, H. H., Iversen, T. G., Walchli, S., Sandvig, K. Transport of ricin from endosomes to the Golgi apparatus is regulated by Rab6A and Rab6A. Traffic. 7 (6), 663-672 (2006).
  63. Mallard, F., Johannes, L. Shiga toxin B-subunit as a tool to study retrograde transport. Methods in Molecular Medicine. 73, 209-220 (2003).
  64. Mallard, F., et al. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of Cell Biology. 143 (4), 973-990 (1998).
  65. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cellular Microbiology. 10 (5), 1130-1139 (2008).
  66. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. The Journal of Biological Chemistry. 272 (31), 19554-19561 (1997).
  67. Saint-Pol, A., et al. Clathrin adaptor epsinR is required for retrograde sorting on early endosomal membranes. Developmental Cell. 6 (4), 525-538 (2004).
  68. Amessou, M., Popoff, V., Yelamos, B., Saint-Pol, A., Johannes, L. Measuring retrograde transport to the trans-Golgi network. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
  69. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  70. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Reports. 21 (11), 3256-3270 (2017).
  71. Dick, G., Grondahl, F., Prydz, K. Overexpression of the 3′-phosphoadenosine 5′-phosphosulfate (PAPS) transporter 1 increases sulfation of chondroitin sulfate in the apical pathway of MDCK II cells. Glycobiology. 18 (1), 53-65 (2008).
  72. Fruholz, S., Fassler, F., Kolukisaoglu, U., Pimpl, P. Nanobody-triggered lockdown of VSRs reveals ligand reloading in the Golgi. Nature Communications. 9 (1), 643 (2018).

Tags

NanobodyEndocytic UptakeRetrograde TransportTrans-Golgi NetworkCell Surface ReceptorsFluorescence MicroscopyElectron MicroscopyTyrosine Sulfation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image