En plade-baseret cytotoksicitet analyse til vurdering af rotte Placental naturlig Killer Cell cytolytisk funktion
Summary
Her giver vi en detaljeret metodologi til at isolere og vurdere cytotoksiske funktion af naturlige dræber celler fra indsamlingerne ved en kolorimetrisk plade assay. Den reducerede livmoder perfusion tryk rotte model af placenta iskæmi blev valgt til at demonstrere antistof-medieret isolation og vurdering af den cytotoksiske funktion af naturlige dræber celler.
Abstract
Det er velkendt, at decidobbelte naturlige dræber (NK) celler spiller en afgørende rolle i etablering og vedligeholdelse af normal graviditet. Nylige undersøgelser har vist en ændret population af cirkulerende og decidobbelte NK-celler hos kvinder, der lider af ugunstige graviditetskomplikationer, såsom recidiverende abort og præeklampsi. Undersøgelser fra vores gruppe har vist, at hypertension under graviditet er forbundet med en øget population af aktiverede NK celler i placenta baseret på udtryk for overflade aktiverings markører. Dette manuskript indeholder en detaljeret protokol til vurdering af den cytotoksiske funktion af NK-celler isoleret fra placenta i en preeclampsia-lignende dyremodel af kirurgisk induceret placenta iskæmi. Følgende trin er beskrevet i detaljer: generering af enkelt cellesuspension, NK celle isolation, ex vivo stimulation, effektor: målcelle Co-kultur, og cytotoksicitet assay.
Introduction
Preeclampsia er en hypertensiv lidelse af graviditeten karakteriseret ved føtale vækst begrænsning, ende organskader og kronisk immun aktivering. Kronisk immun aktivering hos kvinder med præeklampsi fører til øget cirkulerende og placenta inflammatoriske cytokiner, en ubalance i CD4+ T- celler populationer, og en øget population af aktiverede Natural Killer (NK) celler1. Undersøgelser for nylig offentliggjort af vores laboratorium demonstrere en rolle for NK celler i forårsager nogle af Patofysiologi forbundet med preeklampsia i reduceret uterine perfusion Pressure (Rupp) rotte model af præeklampsi. Ved hjælp af flowcytometri til måling af overflade udtryk for aktiverings markører på NK-celler blev der observeret en øget population af aktiverede NK-celler i cirkulation og indsamlingerne af Rupp-rotter sammenlignet med normale drægtige (NP) rotter2.
For at bekræfte flow cytometri observationer blev der udført funktionelle undersøgelser til vurdering af den cytotoksiske aktivitet af NK-celler isoleret fra indsamlingerne af NP og Rupp-rotter. Der er flere metoder til rådighed til vurdering af cytotoksiske funktion af cytotoksiske CD8+ T celler og NK celler. Den gyldne standard for funktionel cytotoksisk analyse er chrom Release assay3. Andre udviklede protokoller anvendes omfatter flow cytometri4, billede cytometri5, calcein Release6, og senest bioluminescens7. Denne video vil give en detaljeret protokol om brug af den veletablerede lactat dehydrogenase (LDH) frigivelse assay til at måle cytotoksiske funktion af NK celler ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt LDH cytotoksicitet assay kit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er en række vigtige nøgle noter at overveje for optimale resultater. Steriliteten af de anvendte celler er meget vigtigt. Efter opsamling af placenta er det vigtigt, at klargøring og isolering af NK-cellerne udføres under sterile forhold i et biosikkerhedskabinet. Da alle celler frigiver LDH ved cellulære skader, skal der desuden udvises omhu for at opnå en høj levedygtighed af NK-cellerne efter isolation og under samkulturprocessen. For meget spontan LDH-frigivelse fra NK-cellerne kan ofte resultere i negativ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af national Heart Lung og Blood Institute af National Institutes of Health under Grant R00HL130456, National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under tildeling P20GM104357, og ved Mississippi INBRE, finansieret af en institutionel Udviklingspris (IDeA) fra National Institutes of General Medical Sciences af National Institutes of Health under tilskudsnummer P20GM103476. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra de nationale sundhedsinstitutter.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
References
- Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
- Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
- Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother’s diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
- Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
- Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).
