Un ensayo de citotoxicidad basada en placas para la evaluación de la función citolítica de la célula asesina natural placentaria de rata
Summary
Aquí, proporcionamos una metodología detallada para aislar y evaluar la función citotóxica de las células asesinas naturales de las en por un ensayo de placa colorimétrica. Se eligió el modelo reducido de la rata de perfusión uterina de isquemia placentaria para demostrar el aislamiento mediado por anticuerpos y la evaluación de la función citotóxica de las células asesinas naturales.
Abstract
Es bien sabido que las células del asesino natural decidua (NK) juegan un papel crítico en el establecimiento y el mantenimiento del embarazo normal. Estudios recientes han demostrado una población alterada de células NK circulantes y deciduales en mujeres que sufren complicaciones adversas en el embarazo como aborto recurrente y preeclampsia. Estudios de nuestro grupo han demostrado que la hipertensión en el embarazo está asociada con un aumento de la población de células NK activadas en la placenta basada en la expresión de marcadores de activación de superficie. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para evaluar la función citotóxica de las células NK aisladas de las en en un modelo animal parecido a la preeclampsia de isquemia placentaria inducida quirúrgicamente. Los siguientes pasos se describen detalladamente: generación de suspensión de célula única, aislamiento de células NK, estimulación ex vivo, efector: cocultivo celular objetivo y ensayo de citotoxicidad.
Introduction
La preeclampsia es un trastorno hipertensivo del embarazo caracterizado por la restricción del crecimiento fetal, el daño al órgano final y la activación inmunitaria crónica. La activación inmunitaria crónica en mujeres con preeclampsia conduce a un aumento de la circulación y citoquinas inflamatorias placentarias, un desequilibrio en las poblaciones de células T CD4+ , y un aumento de la población de las células de Killer natural activado (NK)1. Los estudios recientemente publicados por nuestro laboratorio demuestran un papel para las células NK en la causa de parte de la fisiopatología asociada con la preeclampsia en el modelo de la rata de la presión de perfusión uterina reducida (RUPP) de la preeclampsia. Utilizando citometría de flujo para medir la expresión superficial de los marcadores de activación en las células NK, se observó un aumento de la población de células NK activadas en la circulación y en de las ratas Rupp en comparación con las ratas embarazadas normales (NP)2.
Para confirmar las observaciones de citometría de flujo, se realizaron estudios funcionales para evaluar la actividad citotóxica de células NK aisladas de las en de ratas NP y Rupp. Hay varios métodos disponibles para la evaluación de la función citotóxica de las células T de citotóxicos CD8+ y las células NK. El estándar de oro para el análisis citotóxico funcional es el ensayo de liberación de cromo3. Otros protocolos desarrollados utilizados incluyen citometría de flujo4, citometría de imagen5, calceína Release6, y más recientemente bioluminiscencia7. Este video proporcionará un protocolo detallado sobre el uso del ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) bien establecido para medir la función citotóxica de las células NK utilizando un kit de ensayo de citotoxicidad LDH disponible comercialmente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay una serie de notas clave importantes a tener en cuenta para obtener resultados óptimos. La esterilidad de las células utilizadas es muy importante. Después de la recolección de la placenta, es importante que la preparación y el aislamiento de las células NK se realicen en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad. Además, debido a que todas las células liberan LDH sobre el daño celular, se debe tener cuidado para obtener una alta viabilidad de las células NK después del aislamiento y durante el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de pulmón y sangre del corazón de los institutos nacionales de salud bajo la subvención R00HL130456, el Instituto Nacional de ciencias médicas generales de los institutos nacionales de salud bajo el premio P20GM104357, y por el Mississippi INBRE, financiado por un premio de desarrollo institucional (IDeA) de los institutos nacionales de ciencias médicas generales de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número P20GM103476. El contenido es exclusivamente responsabilidad de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
References
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