Um ensaio de citotoxicidade à base de placas para a avaliação da função citolítica de células assassinas naturais do rato
Summary
Aqui, nós fornecemos uma metodologia detalhada para isolar e avaliar a função citotóxica de pilhas naturais do assassino das placentas por um ensaio colorimétrico da placa. O modelo reduzido de rato de pressão de perfusão uterina de isquemia placentária foi escolhido para demonstrar o isolamento e a avaliação mediada por anticorpos da função citotóxica de células assassinas naturais.
Abstract
É sabido que as pilhas decidual natural do assassino (NK) jogam um papel crítico no estabelecimento e na manutenção da gravidez normal. Estudos recentes demonstraram uma população alterada de células NK circulantes e decidual em mulheres que sofrem de complicações adversas da gravidez, como aborto espontâneo e pré-eclampsia. Os estudos de nosso grupo mostraram que a hipertensão na gravidez é associada com um aumento da população de pilhas NK ativadas na placenta baseada na expressão de marcadores de ativação de superfície. Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para avaliar a função citotóxica de pilhas de NK isoladas das placentas em um preeclampsia-como o modelo animal da isquemia placentária cirùrgica induzida. As seguintes etapas são descritas em detalhe: geração da única suspensão da pilha, isolação da pilha de NK, estimulação ex vivo, Effector: cocultura da pilha de alvo, e o ensaio da citotoxicidade.
Introduction
A pré-eclâmpsia é uma doença hipertensiva da gravidez caracterizada por restrição de crescimento fetal, dano de órgão final e ativação imune crônica. A ativação imune crônica em mulheres com pré-eclampsia leva a aumento das citocinas inflamatórias circulantes e placentárias, um desequilíbrio nas populações de células T CD4+ e uma população aumentada de células de Killer natural (NK) ativadas1. Os estudos publicados recentemente por nosso laboratório demonstram um papel para pilhas de NK em causar alguma da patofisiologia associada com o pré-eclâmpsia no modelo reduzido do rato da pressão de perfusão uterine (Rupp) do pré-eclâmpsia. Utilizando-se a citometria de fluxo para medir a expressão superficial dos marcadores de ativação nas células NK, observou-se aumento da população de células NK ativadas na circulação e placentas de ratos RUPP comparados aos ratos gestantes normais (NP)2.
Para confirmar as observações de citometria de fluxo, foram realizados estudos funcionais para avaliar a atividade citotóxica de células NK isoladas das placentas dos ratos NP e RUPP. Existem vários métodos disponíveis para a avaliação da função citotóxica de células T citotóxicas CD8+ e células NK. O padrão-ouro para análise citotóxica funcional é o ensaio de liberação de cromo3. Outros protocolos desenvolvidos utilizados incluem citometria de fluxo4, citometria de imagem5, liberação de calceina6e, mais recentemente, bioluminescência7. Este vídeo fornecerá um protocolo detalhado em usar o ensaio bem estabelecido da liberação do desidrogenase do lactato (LDH) para medir a função citotóxica de pilhas de NK usando um jogo comercialmente disponível do ensaio da citotoxicidade de LDH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Há um número de importantes notas-chave a considerar para obter resultados ideais. A esterilidade das células utilizadas é muito importante. Após a coleta da placenta, é importante que a preparação e o isolamento das células NK sejam realizados condições estéreis em um gabinete de biossegurança. Além disso, como todas as células liberam LDH após dano celular, deve-se tomar cuidado para obter uma alta viabilidade das células NK após o isolamento e durante o processo de cocultura. Demasiada liberação es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo National Heart Lung e Blood Institute dos institutos nacionais de saúde a subvenção R00HL130456, o Instituto Nacional de ciências médicas gerais dos institutos nacionais de saúde o prêmio P20GM104357, e pelo Mississippi INBRE, financiado por um prêmio de desenvolvimento institucional (IDeA) dos institutos nacionais de ciências médicas gerais dos institutos nacionais de saúde o número de subvenção P20GM103476. O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
References
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