Ein platebasierter Cytotoxicity Assay zur Bewertung der Rate Placental Natural Killer Cell Cytolytic Funktion
Summary
Hier stellen wir eine detaillierte Methodik zur Verfügung, um die zytotoxische Funktion natürlicher Killerzellen von den Plazenta durch einen farbimetrischen Plattentat zu isolieren und zu bewerten. Das reduzierte Mutterperfusionsdruckrattenmodell der Plazenta-Ischämie wurde ausgewählt, um die antikörpervermittelte Isolierung und Beurteilung der zytotoxischen Funktion natürlicher Killerzellen zu demonstrieren.
Abstract
Es ist allgemein bekannt, dass dezidale Naturkiller (NK) eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und Aufrechterhaltung der normalen Schwangerschaft spielen. Neuere Studien haben gezeigt, dass sich bei Frauen, die an negativen Schwangerschaftskomplikationen wie wiederkehrenden Fehlgeburten und Präeklampsie leiden, eine veränderte Population von zirkulierenden und dezidalen NK-Zellen verändert. Studien unserer Gruppe haben gezeigt, dass Bluthochdruck in der Schwangerschaft mit einer erhöhten Population von aktivierten NK-Zellen in der Plazenta auf der Grundlage der Expression von Oberflächenaktivierungsmarkern verbunden ist. Dieses Manuskript liefert ein detailliertes Protokoll, um die zytotoxische Funktion von NK-Zellen zu beurteilen, die von Placentas in einem präeklampsia-ähnlichen Tiermodell der chirurgisch induzierten Plazentämie isoliert sind. Die folgenden Schritte werden detailliert beschrieben: Generierung von Einzelzellenaufhängung, NK-Zell-Isolierung, Ex-vivo-Stimulation, Effektor: Zielzellenkultur und der Zytotoxizitäts-Test.
Introduction
Die Präeklampsie ist eine hypertensive Störung der Schwangerschaft, die durch fetale Wachstumseinschränkung, End-Organschäden und chronische Immunaktivierung gekennzeichnet ist. Die chronische Immunaktivierung bei Frauen mit Präeklampsie führt zu vermehrten zirkulierenden und plazentalen entzündlichen Zytokinen, einem Ungleichgewicht in CD4+ T-Zellen-Populationen und einer erhöhten Population vonaktivierten Naturkillerzellen (NK) 1. Studien, die kürzlich in unserem Labor veröffentlicht wurden, zeigen eine Rolle für NK-Zellen bei der Entstehung einiger der Pathophysiologie, die mit Präeklampsie im Rattenmodell “Reduced UUPP” (RUPP) der Präeklampsie in Verbindung gebracht wird. Mit Hilfe der Strömungszytometrie wurde eine erhöhte Population von aktivierten NK-Zellen im Kreislauf und Placentas von RUPP-Ratten im Vergleich zu normalen schwangeren (NP) Ratten beobachtet.
Um die Strömungszytometrie-Beobachtungen zu bestätigen, wurden funktionelle Studien durchgeführt, um die zytotoxische Aktivität von NK-Zellen zu beurteilen, die von den Plazenta von NP und RUPP-Ratten isoliert wurden. Es gibt mehrere Methoden zur Beurteilung der zytotoxischen Funktion von zytotoxischen CD8+ T-Zellen und NK-Zellen. Der Goldstandard für die funktionelle zytotoxische Analyse ist der Chrom-Release-Test3. Weitere entwickelte Protokolle,die verwendet werden, sind die Fließzytometrie 4, die Bildcytometrie 5, die Kalkein-Version6und zuletzt die Biolumineszenz7. Dieses Video wird ein detailliertes Protokoll über die Verwendung des gut etablierten Laktat-Dehydrierungs-Tests (LDH) zur Messung der zytotoxischen Funktion von NK-Zellen mit einem kommerziell erhältlichen LDH-Zytotoxizitäts-Assay-Kit liefern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt eine Reihe wichtiger Schlüsselangaben, die für optimale Ergebnisse zu berücksichtigen sind. Die Sterilität der verwendeten Zellen ist sehr wichtig. Nach der Sammlung der Plazenta ist es wichtig, dass die Vorbereitung und Isolierung der NK-Zellen unter sterilen Bedingungen in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt wird. Da alle Zellen LDH bei Zellschäden freisetzen, sollte man außerdem darauf achten, dass die NK-Zellen nach der Isolation und während des Ko-Kulturprozesses eine hohe Lebensfähigkeit der N…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt vom National Heart Lung and Blood Institute der National Institutes of Health im Rahmen des Stipendiums R00HL130456, dem National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter dem Preis P20GM104357, und von der Mississippi INBRE, finanziert durch einen Institutional Development Award (IDeA) von den National Institutes of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer P20GM103476. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und vertritt nicht notwendigerweise die offiziellen Ansichten der Nationalen Gesundheitsinstitute.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
References
- Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
- Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
- Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother’s diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
- Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
- Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).
