На основе пластины цитотоксичность анализ для оценки крысы плацентарной естественной клетки убийцы Цитолитические функции
Summary
Здесь мы предоставляем подробную методологию, чтобы изолировать и оценить цитотоксическую функцию естественных киллеров из плаценты с помощью цветометрического анализа пластины. Снижение маточных перфузионного давления крысы модель плацентарного, был выбран, чтобы продемонстрировать антитело-опосредованной изоляции и оценки цитотоксической функции естественных клеток убийцы.
Abstract
Хорошо известно, что децидвойные естественные клетки убийцы (НК) играют решающую роль в установлении и поддержании нормальной беременности. Недавние исследования продемонстрировали измененную популяцию циркулирующих и децидуальных НК-клеток у женщин, страдающих от неблагоприятных осложнений беременности, таких как рецидивирующий выкидыш и преэклампсия. Исследования, проведенные нашей группой, показали, что гипертония при беременности связана с увеличением популяции активированных НК-клеток в плаценте на основе экспрессии маркеров поверхностной активации. Данная рукопись представляет собой подробный протокол для оценки цитотоксической функции НК-клеток, изолированных от плаценты в виде животной модели хирургически индуцированной плацентарной иоэклампсии. Ниже описаны следующие этапы: Генерация одноклеточной суспензии, НК-клеточная изоляция, стимуляция в естественных условиях, эффектор: Целевая клеточная сокультура и цитотоксичность.
Introduction
Преэклампсия-гипертензивное расстройство беременности, характеризующееся ограничением роста плода, повреждением конечного органа и хронической иммунной активацией. Хроническая иммунная активация у женщин с преэклампсией приводит к увеличению циркулирующих и плацентарных воспалительных цитокинов, дисбаланс в CD4+ т-клеток населения, и увеличение популяции активированных естественных киллеров (НК) клеток1. Исследования, недавно опубликованные нашей лабораторией, демонстрируют роль НК-клеток в возникновении некоторых патофизиологии, ассоциируемых с преэклампсией в «уменьшении давления маточных перфузии» (Рапп), модели преэклампсии. Использование потока цитометрии для измерения поверхностного выражения маркеров активации на НК-клеток, увеличение популяции активированных НК-клеток в обращении и плаценты Рапп крыс по сравнению с нормальным беременных (НП) крысы наблюдались2.
Для подтверждения наблюдений за потоком цитометрии были выполнены функциональные исследования для оценки цитотоксической активности НК-клеток, выделенных из плаценты НП и крыс РУППП. Существует несколько методов оценки цитотоксической функции цитотоксических CD8+ т-клеток и НК-клеток. Золотым стандартом функционального цитотоксического анализа является анализ высвобождения хрома3. Другие разработанные протоколы, используемые включают поток цитометрия4, изображение цитометрии5, calcein релиз6, и совсем недавно биолюминесценции7. Это видео будет предоставлять подробный протокол об использовании хорошо наладившейся лактата дегидрогеназы (LDH) релиз анализа для измерения цитотоксической функции НК-клеток с использованием коммерчески доступных LDH цитотоксичность анализа комплекта.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует ряд важных ключевых заметок для рассмотрения для достижения оптимальных результатов. Стерильность используемых клеток очень важна. После сбора плаценты важно, чтобы подготовка и изоляция НК-клеток выполняли в стерильных условиях в кабинете биобезопасности. Кроме того, пос…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана национального института легких и крови Институт национальных институтов здравоохранения в соответствии с грантом R00HL130456, Национальный институт общих медицинских наук национальных институтов здравоохранения под награду P20GM104357, и Миссисипи ИНБРЕ, финансируемых за счет институционального развития премии (идея) из Национального института общих медицинских наук национальных институтов здравоохранения на грант номер P20GM103476. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно представляет официальные взгляды национальных институтов здравоохранения.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
References
- Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
- Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
- Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother’s diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
- Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
- Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).
