A القائم علي اللوحة فحص الخلايا الخلوية لتقييم الفئران المشيمة الطبيعية خليه القاتل Cytolytic وظيفة
Summary
هنا ، ونحن نقدم منهجيه مفصله لعزل وتقييم وظيفة السامة للخلايا من الخلايا القاتلة الطبيعية من مشيمة عن طريق فحص لوحه الملونة. تم اختيار نموذج الفئران الضغط ترويه المنخفضة من الاسكيميه المشيمة لإثبات العزلة بوساطة الأجسام المضادة وتقييم الوظيفة السامة للخلايا من الخلايا القاتلة الطبيعية.
Abstract
ومن المعروف جيدا ان خلايا القاتل الطبيعي الساقطيه (NK) تلعب دورا حاسما في إنشاء والحفاظ علي الحمل العادي. وقد أظهرت الدراسات الحديثة السكان المتغيرة من الخلايا المتداولة و الساقطيه NK في النساء الذين يعانون من مضاعفات الحمل السلبية مثل الإجهاض المتكرر ومقدمات الارتعاج. وقد أظهرت الدراسات من مجموعتنا ان ارتفاع ضغط الدم في الحمل يرتبط مع زيادة عدد الخلايا المنشطة NK في المشيمة استنادا إلى التعبير عن علامات التنشيط السطحية. توفر هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتقييم الوظيفة السامة للخلايا من خلايا ناغورني كاراباخ المعزولة عن الاسترضاء في نموذج حيواني شبيه بتسمم الحمل من نقص ترويه المشيمة المستحث جراحيا. يتم وصف الخطوات التالية بالتفصيل: توليد تعليق خليه واحده ، وعزل الخلايا NK ، والتحفيز الحيوي السابق ، المستجيب: الخلية المستهدفة الثقافة المشتركة ، وفحص الخلايا الخلوية.
Introduction
تسمم الحمل هو اضطراب ارتفاع ضغط الدم الذي يتسم به تقييد نمو الجنين ، وتلف الأعضاء النهائية ، والتنشيط المناعي المزمن. يؤدي التنشيط المناعي المزمن لدي النساء اللاتي يعانين من الارتعاج إلى زيادة تداول السايتوكينات التهابيه المشيمة ، وعدم التوازن في الخلايا التائية للخلايا ، وزيادة عدد الخلايا النشطة القاتلة الطبيعية (NK)1. وتبين الدراسات التي نشرت مؤخرا من قبل مختبرنا دورا للخلايا ناغورني كاراباخ في التسبب في بعض من الفيزيولوجيا المرضية المرتبطة بمقدمات الارتعاج في نموذج الفئران الضغط Perfusion الرحمية (RUPP) من الارتعاج. باستخدام التدفق الخلوي لقياس التعبير السطحي لعلامات التنشيط علي خلايا ناغورني كاراباخ ، زاد عدد السكان من خلايا ناغورني كاراباخ المنشطة في الدورة الدموية و مشيمة من الفئران rupp مقارنه مع الفئران الحامل العادي (NP) لوحظ2.
لتاكيد الملاحظات تدفق الخلوية ، أجريت دراسات وظيفية لتقييم النشاط السامة للخلايا من الخلايا NK معزولة من مشيمة من الفئران NP و rupp. هناك العديد من الطرق المتاحة لتقييم وظيفة السامة للخلايا من الخلاياCD8 + T السامة للخلايا والخلايا NK. معيار الذهب للتحليل السام للخلايا وظيفية هو فحص الإفراج عن الكروم3. وتشمل البروتوكولات المتقدمة الأخرى المستخدمة التدفق الخلوي4، الصورة الخلوية5، calcein الإصدار6، والأكثر حداثة التالق7. سيوفر هذا الفيديو بروتوكولا مفصلا بشان استخدام المقايسة الراسخة لنازعه الهيدروجين (LDH) لقياس الوظيفة السامة للخلايا في الخلايا NK باستخدام مجموعه المقايسة الخلوية المتاحة تجاريا LDH.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهناك عدد من الملاحظات الرئيسية الهامه للنظر في النتائج المثلي. العقم من الخلايا المستخدمة مهم جدا. بعد جمع المشيمة ، من المهم ان يتم اعداد وعزل خلايا ناغورني كاراباخ في ظل ظروف معقمه في خزانه السلامة الاحيائيه. وعلاوة علي ذلك ، لان جميع الخلايا الإفراج عن LDH علي الاضرار الخلوية ، ينبغي توخ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت المنحة R00HL130456 ، والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة ببموجب القرار P20GM104357 ، ميسيسيبي INBRE ، الممولة من قبل جائزه التنمية المؤسسية (IDeA) من المعاهد الوطنية للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة تحت منحه رقم P20GM103476. والمضمون هو المسؤولية الوحيدة للمؤلفين ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
References
- Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
- Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
- Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother’s diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
- Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
- Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).
