ラット胎盤ナチュラルキラー細胞細胞溶解機能の評価のためのプレートベースの細胞毒性アッセイ
Summary
ここでは、比色プレートアッセイによって胎盤からナチュラルキラー細胞の細胞毒性機能を分離・評価するための詳細な方法論を提供する。胎盤虚血の減少した子宮灌流圧ラットモデルは、抗体媒介性の分離とナチュラルキラー細胞の細胞傷害機能の評価を実証するために選ばれた。
Abstract
Decidual ナチュラルキラー (NK) 細胞が正常妊娠の確立と維持に重要な役割を果たすことはよく知られています。最近の研究は、再発流産や子癇前症などの有害な妊娠合併症に苦しむ女性で、循環し、decidual NK 細胞の変化した人口を示しました。我々のグループからの研究では、妊娠中の高血圧は、表面活性化マーカーの発現に基づいて、胎盤の活性化された NK 細胞の増加した集団と関連していることが示されている。本稿では、外科的に誘導された胎盤虚血の子癇前症様動物モデルに胎盤から分離した NK 細胞の細胞毒性機能を評価するための詳細なプロトコールを提供する。以下のステップについて詳細に説明する: 単一細胞懸濁液の生成、NK 細胞単離、ex in vivo 刺激、エフェクター: 標的細胞共培養、および細胞傷害アッセイ。
Introduction
子癇前症は、胎児の発育制限、末端器官の損傷および慢性免疫活性化によって特徴付けられる妊娠の高血圧性障害である。子癇前症の女性における慢性免疫活性化は、増加した循環および胎盤炎症性サイトカイン、CD4+ T 細胞集団の不均衡、および活性化されたナチュラルキラー (NK) 細胞の集団の増加につながる。当研究室が最近発表した研究は、子癇前症の減少した子宮灌流圧 (ラップ) ラットモデルにおける子癇前症に関連する病態生理学の一部を引き起こすことにおける NK 細胞の役割を実証する。フローサイトメトリーを用いて、NK 細胞に対する活性化マーカーの表面発現を測定するために、正常な妊娠 (NP) ラットと比較してラップラットの循環および胎盤における活性化 NK 細胞の集団の増加が観察された2。
フローサイトメトリー観測を確認するために、NP およびラップラットの胎盤から単離された NK 細胞の細胞傷害活性を評価するための機能的研究を行った。細胞傷害性 CD8+ T 細胞および NK 細胞の細胞毒性機能の評価のために利用可能ないくつかの方法がある。機能的細胞傷害性分析のための金本位は、クロム放出アッセイ3である。利用される他の発達したプロトコルは、フローサイトメトリー4、イメージサイトメトリ5、カルセインリリース6、および最も最近の生物発光7を含む。このビデオでは、市販の LDH 細胞毒性アッセイキットを使用して NK セルの細胞毒性機能を測定するために、十分に確立された乳酸脱水素酵素 (LDH) 放出アッセイを用いた詳細なプロトコルを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
最適な結果を得られるように考慮すべき重要事項がいくつかあります。利用される細胞の無菌性は非常に重要である。胎盤の採取の後、NK 細胞の調製および単離がバイオセーフティキャビネットの無菌条件下で行われることが重要です。さらに、すべての細胞が細胞損傷によって LDH を放出するので、分離後および共培養プロセス中に NK 細胞の高い生存率を得るために注意が必要である。NK ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、グラント R00HL130456 の下で国立衛生研究所の国立心臓肺と血液研究所によってサポートされていました, 国立衛生研究所の P20GM104357 賞の下で, そして、ミシシッピ INBRE は、認可番号 P20GM103476 の下で国立衛生研究所の一般医学研究所からの制度的開発賞 (アイデア) によって資金を提供されました。コンテンツは、著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
References
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