Discriminazione dei sette sottoinsiemi delle cellule immuni di due-fluorocromo flusso Cytometry

Citometria a flusso è una tecnica che è stata sviluppata per analizzare più parametri su singole particelle ad una velocità di diverse migliaia di eventi al secondo¹. Esempi di esemplari analizzati tramite flusso cytometry includono, ma non sono limitati a, cellule, perline, batteri, vescicole e cromosomi. Un sistema fluidico dirige le particelle nel punto di interrogatorio dove ogni particella si interseca il percorso con uno o più laser, e più parametri vengono registrati per ulteriori analisi. Disperde in avanti e laterali, generati dallo scattering della luce pura laser, vengono utilizzati per identificare la popolazione target e recuperare informazioni sulla dimensione relativa e la complessità interna/granularità delle particelle, rispettivamente. Tutti gli altri parametri, che rappresentano la maggior parte dei dati in un analisi cytometric di flusso, sono derivati dalle sonde fluorocromo-etichetta che riconoscono e si legano a specifici obiettivi sulle particelle di interesse.

Citometria a flusso è uno strumento primario per gli studi immunologici identificare e caratterizzare le popolazioni delle cellule. Per sezionare la complessità del sistema immunitario, pannelli multicolor sono in continua evoluzione per espandere il numero di marcatori contemporaneamente registrate per profonda immunophenotyping delle popolazioni delle cellule¹. Questo sta portando allo sviluppo di strumenti più capaci e fluorocromi, con recente citometri a flusso High-end superiore a 20 parametri fluorescenti. Ciò si traduce nella progettazione di studio complesso a causa della sovrapposizione spettrale fluorocromo e costi più elevati connessi con operatori qualificati ed etichettatura su ordinazione dell’anticorpo. In diversi casi, complessità e i costi sono ridotti utilizzando pannelli separati di marcatori per diverse popolazioni cellulari. Questo approccio, tuttavia, è soggetto a errori, riduce le informazioni in ogni pannello e può essere difficile da applicare ai campioni con un numero limitato di cellule. Inoltre, aumentando il numero di marcatori preclude immunophenotyping profondo sugli strumenti con meno parametri fluorescenti. Precedentemente abbiamo sviluppato un protocollo di colorazione per identificare le principali popolazioni umane immuni (CD4⁺ e CD8⁺ T cellule, cellule T γδ, cellule B, cellule NK e dei monociti) in cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) combinando sette indicatori di lignaggio utilizzando solo due fluorocromi anziché sette necessaria utilizzando il tradizionale “un fluorocromo-uno marcatore” approccio (www.hcdm.org)^2,3. Il nostro rapporto iniziale esplorato e convalidato la nozione di combinare sette marcatori in due fluorocromi per immunophenotyping profonda. In questo rapporto, presentiamo un protocollo passo a passo per isolare e macchiare le cellule del sangue periferico, concentrandosi sull’aspetto pratico e risoluzione dei problemi per ottenere una colorazione di successo.

Questo protocollo è basato sull’osservazione che i marcatori lineage hanno un’espressione costante sulla superficie delle cellule e che ogni popolazione delle cellule ha un’esclusiva combinazione di marcatori di lignaggio. In PBMCs, espressione CD3 suddivide le cellule immuni in due categorie principali: i linfociti T CD3 positivi e cellule CD3-negative. All’interno del sottogruppo positivo CD3, CD4⁺, CD8⁺ e cellule T γδ possono essere separate usando gli anticorpi destinati esclusivamente a CD4, CD8 e il recettore γδ. In modo paragonabile, all’interno del sottogruppo negativo CD3, cellule B, cellule NK e dei monociti possono essere identificati in modo univoco utilizzando anticorpi contro CD19, CD56 e CD14, rispettivamente. In un approccio di marcatore fluorocromo-uno uno standard, anti-CD3-CD4,-CD8, – CD14,-CD19-CD56 e TCR – γδ gli anticorpi vengono rilevati con sette diversi fluorocromi. Il nostro approccio combina anti-CD3 – CD56 e TCR – γδ anticorpi in un fluorocromo (etichettato per fluorocromo convenienza A) e anti-CD4,-CD8, – CD14 e – CD19 anticorpi in un fluorocromo diverso (fluorocromo B). Questo è possibile tramite una combinazione di titolazione degli anticorpi e l’espressione dell’antigene differenziale. Entrambi CD4⁺ e CD8⁺ T cellule sono positive per l’anticorpo anti-CD3 in fluorocromo A, ma possono essere separati in fluorocromo B massimizzando l’espressione del CD8 segnale durante l’inserimento, con una titolazione ad hoc, il segnale di CD4 tra il CD8 e le cellule di CD3 positivi-CD4/CD8 doppia negazione. Cellule T γδ esprime il livello di CD3 superiore CD4 e CD8, e pertanto possono essere identificati come CD3 alta⁴. Questo segnale è ulteriormente potenziato dall’etichettatura γδ cellule T in fluorocromo A con un anticorpi di anti-TCR γδ, migliorando così la separazione tra CD3 basso T cellule e cellule di alta γδ T CD3. Le cellule B possono essere identificate come CD3^– di fluorocromo A e CD19⁺ in fluorocromo B. Per separare le cellule di NK CD3 negative dalle cellule di B, un anticorpo anti-CD56 fu adibito a fluorocromo A anti-CD3. Questo è possibile perché CD56 espressi sulla cellula NK ad un livello molto inferiore rispetto CD3 su cellule T⁵. Infine, i monociti possono essere individuati tramite una combinazione di proprietà di forward-side scatter ed espressione di CD14 in fluorocromo B.

L’idea di combinare fino a quattro marcatori utilizzando due fluorocromi è stato tentato già con successo prima delle^6,7,8ed è stato utilizzato in un protocollo clinico per identificare popolazioni linfocitarie maligni⁹ . Un rapporto precedente anche combinato sette indicatori (con differente specificità dal marcatori che abbiamo usato nel nostro protocollo) utilizzando due fluorocromi, ma questo approccio invocata una complessa l’etichettatura di ciascun anticorpo con quantità variabile di fluorocromo¹⁰. Questo è in contrasto con il nostro metodo che utilizza anticorpi disponibili in commercio e può essere adattato per la configurazione dello strumento e possa avvantaggiarsi della nuova generazione dei fluorocromi polimero.

L’obiettivo generale di questa metodologia è quello di espandere i limiti ottici della maggior parte dei citometri a flusso permettendo la registrazione di cinque ulteriori indicatori per interrogare le popolazioni delle cellule complesse. Di conseguenza, avanzata analisi immunologica può essere eseguita su citometri a flusso fluorocromo conveniente 6-10 e 2-3 fluorocromo campo strumenti possono raggiungere notevoli risultati nelle aree con risorse limitate. Strumenti high-end possono inoltre beneficiare di questo approccio utilizzando fluorocromi supplementari per compire più profonda analisi di citometria a flusso e creare modularità del flusso cytometric pannelli diversi lignaggi al tempo stesso¹¹di targeting. Questo può potenzialmente ridurre il numero di pannelli utilizzati in citometria a flusso modulare immunophenotyping e ridurre i costi, errori e tempo di trattamento. Questo approccio è anche molto adatto nel caso di campioni clinici con numero limitato di cellule.