التمييز من سبع مجموعات فرعية الخلايا المناعية قبل يومين-fluorochrome التدفق الخلوي
Summary
نقدم هنا، بروتوكول سيتوميتريك تدفق لتحديد خلايا CD4+ و CD8+ تي الخلايا والخلايا γδ T، الخلايا ب، ناغورني كاراباخ الخلايا ووحيدات في الدم المحيطي البشري باستخدام فلوروتشروميس اثنين فقط بدلاً من سبعة. مع هذا النهج، يمكن تسجيل خمس علامات إضافية على معظم تدفق سيتوميتيرس.
Abstract
خصائص الخلايا المناعية يعتمد بشدة على قياس التدفق متعدد الألوان لتحديد الفئات السكانية الفرعية استناداً إلى التعبير التفاضلية من علامات السطحية. يتطلب برنامج الإعداد للوحة متعددة الألوان الكلاسيكية الراقية الصكوك والأجسام المضادة المسماة مخصصة، وتصميم الدراسة المتأنية للتقليل من التداخل الطيفي. قمنا بتطوير إجراء تحليل مولتيباراميتريك تحديد السكان المناعة البشرية الرئيسية (CD4+ و CD8+ تي الخلايا والخلايا γδ T، الخلايا ب، ناغورني كاراباخ الخلايا ووحيدات) في الدم عن طريق الجمع بين سبع علامات النسب باستخدام فلوروتشروميس اثنين فقط. استراتيجيتنا يستند إلى الملاحظة التي أعرب علامات النسب عن باستمرار في مزيج فريد من كل سكان الخلية. الجمع بين هذه المعلومات مع معايرة دقيقة للأجسام المضادة يسمح للمحققين بتسجيل خمس علامات إضافية، توسيع حدود معظم تدفق سيتوميتيرس الضوئية. وجها لوجه المقارنة أظهرت أن الغالبية العظمى من السكان الخلايا المناعية في الدم يمكن أن توصف بدقة قابلة للمقارنة بين أسلوب لدينا والكلاسيكية “نهج علامة فلوروتشرومي–واحدة واحدة”، على الرغم من أن هذا الأخير لا يزال أكثر دقة لتحديد السكان مثل NKT الخلايا والخلايا γδ تي. الجمع بين سبع علامات استخدام اثنين فلوروتشروميس يسمح لتحليل السكان الخلايا المناعية المعقدة والعينات السريرية على سيتوميتيرس تدفق fluorochrome معقولة 6-10، وحتى على الصكوك الحقل فلوروتشرومي 2-3 في المناطق ذات الموارد المحدودة. الأدوات الراقية يمكن أن تستفيد أيضا من هذا النهج باستخدام فلوروتشروميس الإضافية لتحقيق التدفق الخلوي تحليل أعمق. هذا النهج أيضا مناسبة لفحص العديد من السكان خلية في حالة العينات السريرية مع عدد محدود من الخلايا جيدا.
Introduction
التدفق الخلوي هو أسلوب الذي استحدث لتحليل معلمات متعددة في جزيئات مفردة بمعدل عدة آلاف من الأحداث في كل ثانية1. أمثلة للعينات التي تم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي وتشمل، ولكن لا تقتصر على، خلايا، والخرز، والبكتيريا وحويصلات والكروموسومات. نظام فلويديك توجيه الجسيمات عند نقطة الاستجواب حيث يتقاطع كل الجسيمات طريقها مع ليزر واحد أو أكثر، وتسجل معلمات متعددة لمزيد من التحليل. تنتشر إلى الأمام والجانب، المتولدة عن تشتت ضوء الليزر نقية، تستخدم لتحديد السكان المستهدفين واسترداد المعلومات حول الحجم النسبي وتعقيد/تقسيمات داخلية من الجسيمات، على التوالي. يتم اشتقاق كافة المعلمات الأخرى، التي تستأثر بمعظم البيانات في تحليل تدفق سيتوميتريك، بتحقيقات المسمى فلوروتشرومي أن تعترف وربط أهداف محددة على الجسيمات ذات الاهتمام.
التدفق الخلوي أداة أساسية للدراسات المناعية تحديد وتوصيف السكان الخلية. تشريح تعقيد النظام المناعي، هي لوحات متعددة الألوان في تطور مستمر لتوسيع عدد العلامات المسجلة في نفس الوقت إيمونوفينوتيبينج العميق للخلية السكان1. يؤدي هذا إلى وضع صكوك أكثر قدرة وفلوروتشروميس، مع سيتوميتيرس تدفق الراقية الأخيرة تتجاوز 20 الفلورية المعلمات. هذه النتائج في تصميم الدراسة معقدة بسبب التداخل الطيفي فلوروتشرومي وارتفاع التكاليف المرتبطة بجسم مخصص مشغلي الوسم والمهرة. في العديد من الحالات، يتم تقليل التعقيد والتكاليف باستخدام لوحات منفصلة لعلامات للسكان خلية مختلفة. هذا النهج، هو عرضه للخطأ ومع ذلك، ويقلل من المعلومات الموجودة في كل لوحة، ويمكن أن يكون صعباً لتطبيقه على عينات مع عدد محدود من الخلايا. وعلاوة على ذلك، تزايد عدد علامات يحول دون إيمونوفينوتيبينج العميق على الصكوك مع معلمات الفلورسنت أقل. أننا سبق أن وضعت بروتوكولا المصبوغة لتحديد السكان المناعة البشرية الرئيسية (CD4+ و CD8+ تي الخلايا والخلايا γδ T، الخلايا ب، ناغورني كاراباخ الخلايا ووحيدات) في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) عن طريق الجمع بين سبع علامات النسب باستخدام فلوروتشروميس اثنين فقط بدلاً من السبعة المطلوبة باستخدام نهج (www.hcdm.org) “علامة فلوروتشرومي–واحدة واحدة” التقليدية2،3. تقريرنا الأولى استكشاف والتحقق من صحة مفهوم الجمع بين علامات سبعة في اثنين فلوروتشروميس إيمونوفينوتيبينج العميق. في هذا التقرير، نقدم بروتوكول خطوة خطوة لعزل ووصمة عار خلايا الدم المحيطية، مع التركيز على الجانب العملي، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها خطوات لتحقيق تلطيخ ناجحة.
ويستند هذا البروتوكول على ملاحظة أن علامات النسب يكون تعبير ثابت على سطح الخلية، وأن كل السكان خلية مزيج حصري من علامات النسب. في ببمكس، والتعبير CD3 الخلايا المناعية تقسم إلى فئتين رئيسيتين هما: لمفاوية T CD3–الإيجابية والسلبية CD3 الخلايا. داخل الفريق الفرعي إيجابية CD3، خلايا CD4+، CD8+ ويمكن فصل الخلايا γδ تي استخدام الأجسام المضادة التي تستهدف فقط CD4، CD8 ومستقبلات γδ. بطريقة مماثلة، ضمن الفريق الفرعي CD3 السلبية، ب الخلايا والخلايا ناغورني-كاراباخ ووحيدات يمكن تعريفه بشكل فريد باستخدام الأجسام المضادة ضد CD19 و CD56 و CD14، على التوالي. في نهج واحد فلوروتشرومي ماركر واحد قياسية، مكافحة-CD3،-CD4،–، CD8-CD14،-يتم الكشف عن الأجسام γδ CD19-CD56 وتكر مع سبعة فلوروتشروميس مختلفة. لدينا نهج يجمع بين مكافحة-CD3-CD56 وأجسام γδ-تكر في أحد فلوروتشرومي (المسمى للراحة فلوروتشرومي A) ومكافحة-CD4،–، CD8-CD14-والأجسام المضادة CD19 في فلوروتشرومي مختلفة (فلوروتشرومي ب). وهذا ممكن عن طريق الجمع بين أضداد معايرة والتعبير مستضد التفاضلية. كلا CD4+ و CD8+ تي الخلايا إيجابية للأجسام المضادة-CD3 في فلوروتشرومي أ، ولكن يمكن فصلهم في فلوروتشرومي ب تحقيق الحد الأقصى من التعبير عن إشارة CD8 بينما تضع، مع معايرة مخصصة، إشارة CD4 بين CD8 و الخلايا النفي المزدوج إيجابية-CD4/CD8 CD3. الخلايا التائية γδ تعرب عن مستوى أعلى من CD3 CD4 و CD8، وذلك يمكن التعرف عليهم ك عالية CD34. كذلك عزز هذه الإشارات بوصفها γδ خلايا تي في فلوروتشرومي أ مع أضداد γδ تكر المضادة، وبالتالي تحسين الفصل بين CD3 منخفضة تي الخلايا والخلايا عالية γδ تي CD3. يمكن تحديد الخلايا ب ك CD3– في فلوروتشرومي أ و CD19+ في فلوروتشرومي ب لفصل CD3 السلبية ناغورني كاراباخ الخلايا من الخلايا باء، كمكافحة-CD3 جسم CD56 المضادة في فلوروتشرومي أ. وهذا ممكن لأنه أعرب عن CD56 في ناغورني كاراباخ الخلايا على مستوى أقل بكثير من CD3 على خلايا تي5. وأخيراً، يمكن تحديد وحيدات عبر مزيج من خصائص مبعثر جانب الأمام والتعبير عن CD14 في فلوروتشرومي ب
فكرة الجمع بين أربع علامات باستخدام فلوروتشروميس اثنين سعت بنجاح قبل6،،من78، وقد استخدمت في بروتوكول سريرية لتحديد السكان اللمفاوية الخبيثة9 . تقرير سابق أيضا ضم سبع علامات (مع خصوصية مختلفة من العلامات مما كنا في أعمالنا البروتوكول) باستخدام اثنين من فلوروتشروميس، ولكن هذا النهج يعتمد على العلامات المعقدة لكل جسم مع كمية متفاوتة من فلوروتشرومي10. هذا هو على النقيض لدينا أسلوب الذي يستخدم الأجسام المضادة المتاحة تجارياً ويمكن تكييفها لتكوين أداة ويمكن الاستفادة من الجيل الجديد من فلوروتشروميس البوليمر.
والهدف العام لهذه المنهجية توسيع حدود بصري لمعظم تدفق سيتوميتيرس تسمح بتسجيل خمس علامات إضافية لاستجواب السكان خلية معقدة. نتيجة لذلك، يمكن إجراء تحليل المناعية متقدمة في المتناول 6-10 fluorochrome تدفق سيتوميتيرس، والصكوك الحقل فلوروتشرومي 2-3 يمكن أن تحقق نتائج ملحوظة في المناطق ذات الموارد المحدودة. الأدوات الراقية يمكن أن تستفيد أيضا من هذا النهج باستخدام فلوروتشروميس إضافية لإنجاز التدفق الخلوي تحليل أعمق وإنشاء وحدات تدفق الألواح سيتوميتريك استهداف الأنساب عدة في الوقت نفسه11. هذا يحتمل أن تقلل عدد اللوحات المستخدمة في وحدات إيمونوفينوتيبينج التدفق الخلوي، وخفض التكاليف، والأخطاء والتعامل مع الوقت. وهذا النهج أيضا جيد جداً مناسبة في حالة العينات السريرية مع عدد محدود من الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد ثبت البروتوكول المعروضة هنا مرنة جداً وحساس للتغيرات في تلطيخ المخزن المؤقت، ودرجة الحرارة وإعداد خلايا الدم المحيطية بسبب التعبير ارتفاع نسب علامات على سطح الخلية. أن الخطوة الأكثر أهمية للحصول على بيانات عالية الجودة، واستنساخه من معايرة الأجسام المضادة. من المذكرة، حيث ينبغي دائ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيده هذه الدراسة بالمعهد الوطني لالتهاب المفاصل وموسكولوسكيليتال والأمراض الجلدية، ، جائزة رقم P30-AR053503؛ مؤسسة استقرارا، www.stablerfoundation.org; الوطني معهد الحساسية والأمراض المعدية، www.niaid.nih.gov، T32AI007247؛ نينا أيرلندا برنامج لصحة الرئة (نيبله)، https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
- Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12 (11), (2017).
- Zola, H., et al. . Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).
- Lambert, C., Genin, C. CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).
- Ginaldi, L., et al. Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry. Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).
- Park, J., Han, K. Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome. Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).
- Mansour, I., et al. Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two. Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).
- Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes. Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).
- Van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).
- Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).
- Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis. Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).
- Maecker, H. T., et al. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry Part A. , (2004).
- Noonan, K. A., et al. Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma. Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).
- Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells. Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).
- Bonecchi, R., et al. Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s. The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).
- Rivino, L., et al. Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).
- Ye, Z. -. J., et al. Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. PloS One. 7 (2), e31710 (2012).
- Speiser, D. E., et al. Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells. European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).
- Caruso, A., et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).
- Brenchley, J. M., et al. Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells. Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).
- Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction. The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).
- Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).
