Discriminatie van zeven immuun cel deelverzamelingen door twee-fluorescerende Stroom Cytometry

Stroom cytometry is een techniek die is ontwikkeld om te analyseren van meerdere parameters op enkele deeltjes met een snelheid van enkele duizenden evenementen per tweede¹. Voorbeelden van monsters geanalyseerd door stroom cytometry omvatten, maar zijn niet beperkt tot, cellen, kralen, bacteriën, blaasjes en chromosomen. Een fluidic systeem regisseert deeltjes op het punt van de ondervraging waar elk deeltje zijn pad kruist met een of meer lasers, en meerdere parameters worden opgenomen voor verdere analyse. Voorwaartse en zijdelingse verstrooit, gegenereerd door de verstrooiing van het zuivere laserlicht, worden gebruikt voor het identificeren van de doelpopulatie en ophalen van informatie over de relatieve omvang en interne complexiteit/granulariteit van deeltjes, respectievelijk. Alle andere parameters, die goed zijn voor het merendeel van de gegevens in een flow cytometrische analyse, worden afgeleid door fluorescerende-geëtiketteerden sondes die worden herkend en binden aan specifieke doelstellingen op de deeltjes van belang.

Stroom cytometry is een primaire hulpmiddel voor immunologische studies te identificeren en te karakteriseren cel populaties. Om te ontleden de complexiteit van het immuunsysteem, multicolor panelen zijn voortdurend in ontwikkeling om uit te breiden het aantal markeringen gelijktijdig opgenomen voor diepe immunophenotyping voor cel populaties¹. Dit leidt tot de ontwikkeling van krachtigere instrumenten en fluorochromes, met recente high-end flow cytometers meer dan 20 TL parameters. Dit resulteert in complexe studie ontwerp als gevolg van fluorescerende spectrale overlap en in hogere kosten in verband met aangepaste antilichaam etikettering en bekwame operatoren. In meerdere gevallen, worden complexiteit en kosten verlaagd door gebruik te maken van afzonderlijke panelen van markers voor andere cel populaties. Deze aanpak, echter is foutgevoelig, vermindert de informatie in elk paneel, en moeilijk toe te passen op monsters met een beperkt aantal cellen kan zijn. Bovendien, verhoging van het aantal markeringen verzet zich tegen diepe immunophenotyping op instrumenten met minder fluorescerende parameters. Eerder ontwikkelden we een kleuring protocol ter identificatie van de grote menselijke immuun populaties (CD4⁺ en CD8⁺ T cellen en γδ T cellen, B-cellen, NK-cellen, monocyten) in perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) door het combineren van zeven lineage markeringen gebruiken slechts twee fluorochromes in plaats van de zeven nodig met behulp van de traditionele “een fluorescerende-een marker” aanpak (www.hcdm.org)^2,3. Ons eerste verslag onderzocht en gevalideerd de notie van het combineren van zeven markers in twee fluorochromes voor diepe immunophenotyping. In dit verslag presenteren wij een stap door stap protocol om te isoleren en vlek perifere bloedcellen, zich te concentreren op het praktische aspect en de stappen om een succesvolle kleuring voor probleemoplossing.

Dit protocol is gebaseerd op de observatie dat geslacht markeringen een constante expressie op het celoppervlak hebben en dat de bevolking van elke cel een exclusieve combinatie van lineage markers heeft. In PBMCs, CD3 expressie immuuncellen onderverdeelt in twee hoofdcategorieën: CD3-positieve T-lymfocyten en CD3-negatieve cellen. Binnen de CD3 positieve deelgroep, CD4⁺, CD8⁺ en γδ T cellen kunnen worden gescheiden met behulp van antilichamen die uitsluitend gericht zijn op CD4, CD8 en de γδ receptor. Op een vergelijkbare manier, binnen de CD3 negatieve deelgroep, kunnen B-cellen, NK-cellen en monocyten uniek worden aangeduid met behulp van antilichamen tegen CD19, CD56 en CD14, respectievelijk. In een standaard aanpak voor een fluorescerende-een marker, anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19 – CD56 en -TCR γδ antilichamen worden gedetecteerd met zeven verschillende fluorochromes. Onze aanpak combineert anti-CD3 – CD56 en -TCR γδ antilichamen in een fluorescerende (gelabeld voor gemak fluorescerende A) en anti-CD4,-CD8, -CD14 en – CD19 antilichamen in een verschillende fluorescerende (fluorescerende B). Dit is mogelijk door een combinatie van titratie van antilichamen en differentiële antigeen expressie. Beide CD4⁺ en CD8⁺ T cellen zijn positief voor het anti-CD3 antilichaam in fluorescerende A, maar zij kunnen worden gescheiden in fluorescerende B maximaliseren van de expressie van de CD8-signaal terwijl het plaatsen, met een ad hoc-titratie, de CD4-signaal tussen de CD8 en de cellen van de positieve-CD4/CD8 dubbel negatief CD3. Γδ T-cellen spreekt hoger niveau van CD3 dan CD4 en CD8 en daarom kunnen zij worden geïdentificeerd als CD3 hoge⁴. Dit signaal wordt verder versterkt door het labelen van γδ T-cellen in fluorescerende A met een anti-TCR γδ antilichamen, dus verbetering van de scheiding tussen CD3 lage T-cellen en CD3 hoge γδ T cellen. B cellen kunnen worden geïdentificeerd als CD3^– in fluorescerende A en CD19⁺ in fluorescerende B. Als u wilt scheiden CD3 negatieve NK cellen van B-cellen, werd een anti-CD56 antistof gebruikt in fluorescerende A als de anti-CD3. Dit is mogelijk omdat CD56 op NK-cel op een veel lager niveau dan CD3 op T cellen^{5 uitgedrukt}. Ten slotte, monocyten kunnen worden geïdentificeerd via een combinatie van vooruit-kant scatter eigenschappen en expressie van CD14 in fluorescerende B.

Het idee van het combineren van maximaal vier markeringen met behulp van twee fluorochromes heeft al met succes geprobeerd voordat^6,7,8, en is gebruikt in een protocol voor klinische te identificeren van kwaadaardige lymfatische populaties⁹ . Een vorig rapport ook gecombineerd zeven markeringen (met verschillende specificiteit van de markers dan wij in ons protocol gebruikt) met behulp van twee fluorochromes, maar deze aanpak gebaseerd op een complexe etikettering van elke antilichaam met variërende hoeveelheid fluorescerende¹⁰. Dit is in tegenstelling tot onze methode die gebruik maakt van verkrijgbare antilichamen en kan worden aangepast aan de configuratie van het instrument en kunt profiteren van de nieuwe generatie van polymeer fluorochromes.

Het algemene doel van deze methodiek is om uit te breiden van de optische grenzen van meeste flow cytometers waardoor de opname van vijf extra markers te ondervragen van complexe cel populaties. Dientengevolge, geavanceerde immunologische analyse kan worden uitgevoerd op betaalbare 6-10 fluorescerende flow cytometers, en 2-3 fluorescerende veld instrumenten kunnen bereiken opmerkelijke resultaten op gebieden met beperkte middelen. High-end instrumenten kunnen ook profiteren van deze aanpak met behulp van extra fluorochromes om diepere stroom cytometry analyse en maken de modulaire stroom cytometrische panelen gericht op verschillende geslachten bij de dezelfde tijd¹¹. Dit kan potentieel het aantal panelen die worden gebruikt in de modulaire immunophenotyping stroom cytometry verminderen en verminderen kosten, fouten en verwerkingstijd. Deze aanpak is ook zeer goed geschikt in het geval van klinische monsters met een beperkt aantal cellen.