Discriminação de sete subconjuntos de células imunes por dois-fluorocromo citometria de fluxo

Citometria de fluxo é uma técnica que foi desenvolvida para analisar vários parâmetros em partículas simples a uma taxa de vários milhares de eventos por segundo¹. Exemplos de espécimes analisados por citometria de fluxo incluem, mas não estão limitados a, células, miçangas, bactérias, vesículas e cromossomos. Um sistema fluídico direciona as partículas no ponto de interrogação, onde cada partícula cruza seu caminho com lasers de um ou mais, e vários parâmetros são gravados para posterior análise. Espalha para a frente e lateral, gerada pela dispersão da luz do laser puro, é usadas para identificar a população-alvo e recuperar informações sobre o tamanho relativo e a complexidade interna/granularidade de partículas, respectivamente. Todos os outros parâmetros, que representam a maioria dos dados em uma análise do fluxo cytometric, são derivados pelo fluorocromo-rotulado de sondas que reconhecem e ligam para alvos específicos das partículas de interesse.

Citometria de fluxo é uma principal ferramenta para estudos imunológicos identificar e caracterizar as populações de células. Para dissecar a complexidade do sistema imunológico, multicoloridos painéis estão constantemente evoluindo para ampliar o número de marcadores simultaneamente gravada para immunophenotyping profunda da célula populações¹. Isso está levando ao desenvolvimento de instrumentos mais capazes e fluorochromes, com recentes citômetros high-end, excedendo 20 parâmetros fluorescentes. Isso resulta em projeto de estudo complexo devido à sobreposição espectral fluorocromo e em custos mais elevados associados com operadores qualificados e rotulagem de anticorpo personalizado. Em vários casos, complexidade e os custos são reduzidos usando painéis separados de marcadores para populações de células diferentes. Esta abordagem, no entanto, está sujeita a erros, reduz as informações em cada painel e pode ser difícil de aplicar a amostras com um número limitado de células. Além disso, aumentar o número de marcadores impede profunda immunophenotyping em instrumentos com menos parâmetros fluorescentes. Anteriormente desenvolvemos um protocolo de coloração para identificar grandes populações imunes humanas (CD4⁺ e CD8⁺ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos) em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) pela combinação de sete marcadores de linhagem usando apenas duas fluorochromes em vez dos sete necessário usando o tradicional “um fluorocromo-um marcador” abordagem (www.hcdm.org)^2,3. Nosso relatório inicial explorado e validado a noção da combinação de sete marcadores em dois fluorochromes para immunophenotyping profundo. Neste relatório, nós apresentamos um protocolo passo a passo para isolar e manchar as células do sangue periféricas, enfocando o aspecto prático e solução de problemas etapas para alcançar uma coloração bem sucedida.

Este protocolo é baseado na observação de que os marcadores de linhagem tem uma expressão constante na superfície das células e que cada população de células tem uma exclusiva combinação de marcadores de linhagem. Em PBMC, CD3 expressão subdivide as células imunes em duas categorias principais: linfócitos T CD3 positivo e células CD3-negativo. Dentro do subgrupo positivo CD3, CD4⁺, CD8⁺ e células γδ T podem ser separadas usando anticorpos que se destinam exclusivamente a CD4, CD8 e o receptor do γδ. De forma comparável, dentro do subgrupo negativo CD3, células B, células NK e monócitos podem ser identificados exclusivamente usando anticorpos contra CD19, CD56 e CD14, respectivamente. Em uma abordagem padrão um fluorocromo-um marcador, anti-CD3,-CD4,-CD8, – CD14,-CD19-CD56 e – TCR γδ anticorpos são detectados com sete diferentes fluorochromes. Nossa abordagem combina anti-CD3 – CD56 e anticorpos de – TCR γδ em um fluorocromo (rotulada para fluorocromo conveniência A) e anti-CD4,-CD8, – CD14 e – CD19 anticorpos em um fluorocromo diferente (fluorocromo B). Isto é possível por uma combinação de titulação de anticorpos e expressão diferencial do antígeno. Ambos os CD4⁺ e CD8⁺ T células são positivas para o anticorpo anti-CD3 em fluocromo A, mas eles podem ser separados em fluorocromo B maximizar a expressão do sinal CD8 ao colocar, com uma titulação ad hoc, o sinal de CD4 entre o CD8 e as células de CD3 positivo-CD4/CD8 dupla negativa. As pilhas de T do γδ expressa o nível superior de CD3 CD4 e CD8, e, portanto, eles podem ser identificados como CD3 alta⁴. Este sinal é ainda mais impulsionado pela rotulagem γδ células T em fluocromo A com um anticorpos anti-TCR γδ, melhorando assim, a separação entre as pilhas de T CD3 baixas e as células de alta γδ T CD3. As células B podem ser identificadas como CD3^– no fluocromo A e CD19⁺ em fluorocromo B. Para separar pilhas NK CD3 negativas de células B, um anticorpo anti-CD56 foi usado em fluocromo A como o anti-CD3. Isso é possível porque o CD56 expressa na célula NK em um nível muito inferior CD3 na T células⁵. Finalmente, os monócitos podem ser identificados através de uma combinação de propriedades de dispersão de lado para a frente e expressão de CD14 em fluorocromo B.

A ideia de combinar até quatro marcadores usando dois fluorochromes tem sido tentada já com êxito antes de^7,6,8e tem sido usada em um protocolo clínico para identificar populações linfocítica malignas⁹ . Um relatório anterior combinada também sete marcadores (com diferente especificidade dos marcadores do que usamos em nosso protocolo) usar dois fluorochromes, mas esta abordagem baseou-se em um complexo de rotulagem de cada anticorpo com quantidade variável de fluorocromo¹⁰. Isto está em contraste com o nosso método que utiliza anticorpos comercialmente disponíveis e pode ser adaptado para a configuração do instrumento e pode tirar proveito da nova geração de fluorochromes de polímero.

O objetivo geral desta metodologia é expandir os limites ópticos da maioria dos citômetros, permitindo a gravação de cinco marcadores adicionais para interrogar populações de células complexas. Como consequência, avançado análise imunológica pode ser realizada em 6-10 acessível fluorocromo citômetros, e instrumentos de campo 2-3 fluorocromo podem alcançar resultados notáveis em áreas com recursos limitados. Instrumentos high-end podem também beneficiar esta abordagem usando fluorochromes extras para realizar análise de citometria de fluxo mais profunda e criar modular fluxo cytometric painéis como alvo várias linhagens no mesmo tempo¹¹. Potencialmente, isso pode reduzir o número de painéis utilizados em citometria de fluxo immunophenotyping modular e reduzir custos, erros e tempo de manuseio. Essa abordagem também é muito bem adequada no caso de amostras clínicas, com número limitado de células.