Дискриминации в семи подмножеств иммунных клеток, два флюрохром проточная цитометрия

Проточной цитометрии — это метод, который был разработан для анализа нескольких параметров на одной частицы со скоростью несколько тысяч событий на втором¹. Примеры образцов анализируемой проточной цитометрии включают, но не ограничиваются, клетки, бусы, бактерии, везикул и хромосом. Аэрогидродинамических системы направляет частиц на допрос точки, где каждая частица пересекает пути с одним или несколькими лазерами, и несколько параметров записаны для дальнейшего анализа. Вперед и боковых рассеивается, порожденных рассеяния чисто лазерного света, используются для выявления целевых групп населения и извлечения сведений о относительный размер и внутренней сложности/гранулярности частиц, соответственно. Все остальные параметры, которые составляют большую часть данных в анализе гранулярных потока, являются производными от флюрохром меченых зондами, которые узнают и связывают для конкретных целей на частицы интерес.

Проточной цитометрии является основным инструментом для иммунологических исследований для выявления и характеристики популяции клеток. Для того чтобы рассечь сложности иммунной системы, многоцветные панели постоянно совершенствуются расширить количество маркеров одновременно записан для глубоких Иммунофенотипирование клеток населения¹. Это приводит к развитию более способными инструментов и флуорохромов, с недавних high-end потока цитофлуориметрами, превышающий 20 люминесцентных параметров. Это приводит в сложные исследования дизайн благодаря флюрохром спектрального наложения и более высокие расходы, связанные с пользовательских антитела маркировки и квалифицированных операторов. В ряде случаев сложность и затраты снижаются с помощью отдельных панелей маркеров для различных клеточных популяций. Этот подход, однако, является ошибка склонными, уменьшает информация в каждой панели и может быть трудно применять образцы с ограниченное количество клеток. Кроме того увеличивая количество маркеров не исключает глубокую Иммунофенотипирование на инструментах с меньшим числом люминесцентных параметров. Ранее мы разработали окрашивание протокол для выявления основных человеческих популяций иммунной (CD4⁺ и CD8⁺ T клетки, γδ T клетки, клетки B, НК-клетки и моноцитов) в мононуклеаров периферической крови (получения), объединив семь lineage маркеров с помощью только два флуорохромов вместо семи требуется, с помощью традиционных «один флюрохром один маркер» подход (www.hcdm.org)^2,3. Наш первоначальный доклад изучены и проверены понятие объединения семи маркеров в двух флуорохромов для глубокой Иммунофенотипирование. В настоящем докладе мы представляем шаг за шагом протокол для изоляции и выведение клеток периферической крови, сосредоточив внимание на практическом аспекте и устранение неисправностей шаги для достижения успешного пятнать.

Этот протокол основывается на том наблюдении, что lineage маркеров константное выражение на поверхности клетки и что каждой популяции клеток имеет исключительное сочетание lineage маркеров. В репликацию, CD3 выражение подразделяет иммунные клетки на две основные категории: CD3-положительных Т-лимфоцитов и клеток CD3-отрицательные. В рамках подгруппы позитивные CD3, CD4⁺, CD8⁺ и γδ T клетки могут быть разделены с помощью антител, ориентированные исключительно на CD4 и CD8 γδ рецептора. Подобным образом, в рамках подгруппы негативные CD3 B клетки, клетки и моноциты могли быть однозначно идентифицированы с помощью антител против CD19, CD56 и CD14, соответственно. В стандартный один маркер флюрохром один подход анти CD3,-CD4,-CD8, – CD14,-CD19, – CD56 и – TCR γδ антитела обнаруживаются с семи различных флуорохромов. Наш подход сочетает в себе анти CD3, – CD56 и – TCR γδ антител в одном флюрохром (с пометкой для удобства флюрохром A) и анти CD4,-CD8, – CD14 и – CD19 антител в различных флюрохром (флюрохром B). Это возможно сочетанием антитела титрования и дифференциального антигена выражения. Обе CD4⁺ и CD8⁺ T клетки являются позитивными на антитела анти CD3, в флюрохром A, но они могут быть разделены в флюрохром B максимальное выражение CD8 сигнала при размещении, с ad hoc титрования, CD4 сигнала между CD8 и CD3 двойное отрицание положительные CD4/CD8 клетки. Т-клетки γδ выражает высокий уровень CD3 чем CD4 и CD8, и поэтому они могут быть определены как CD3 высокой⁴. Этот сигнал далее повышено маркировки γδ Т-клеток в флюрохром A с анти TCR γδ антител, улучшая таким образом разделение между CD3 низкая Т-клетки и клетки высокой γδ T CD3. B клетки могут быть определены как CD3^– в A флюрохром и CD19⁺ в флюрохром б. Чтобы отделить CD3 негативные НК-клетки из клетки B, антитела анти CD56 использовался в флюрохром А как анти CD3. Это возможно потому, что CD56 выразил на NK клеток на гораздо более низком уровне, чем CD3 T клетки⁵. Наконец моноциты могут быть определены через комбинацию вперед стороне разброс свойств и выражение CD14 в флюрохром б.

Идея объединения до четырех маркеров с помощью двух флуорохромов уже успешно предпринята до^6,7,8и был использован в клинический протокол для выявления злокачественных лимфоцитарный населения⁹ . Предыдущий доклад также комбинированные семь маркеры (с различными специфика от маркеров чем мы использовали в наших протокол) с помощью двух флуорохромов, но этот подход опирался на комплекс маркировки каждого антитела с различным количеством флюрохром¹⁰. Это отличается наш метод, который использует коммерчески доступных антител и может быть адаптирована к инструмент конфигурации и могут воспользоваться преимуществами нового поколения флуорохромов полимера.

Общая цель этой методологии является расширение оптических пределы большинства потока цитофлуориметрами, позволяя для записи пяти дополнительных маркеров допросить комплекс клеточных популяций. Как следствие расширенный Иммунологический анализ может быть выполнена на цитофлуориметрами расхода флюрохром доступной 6-10, и 2-3 флюрохром области инструментов можно добиться замечательных результатов в областях с ограниченными ресурсами. Высококачественные инструменты также могут воспользоваться такой подход с использованием дополнительных флуорохромов выполнить более глубокий анализ цитометрия потоков и для создания модульной потока гранулярных панели ориентации несколько линий на же время¹¹. Это потенциально может уменьшить количество панелей, используемых в модульных Иммунофенотипирование проточной цитометрии и снизить затраты, ошибки и время обработки. Этот подход также очень хорошо подходит в случае клинических образцов с ограниченным числом ячеек.