Индукционной системы для кластерных устьиц на лечение погружения раствора сахара в проростках Arabidopsis thaliana
Summary
Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации как побудить кластерных устьиц в семядоли Arabidopsis thaliana саженцев погружения лечение с раствором сахара содержащих средних и как соблюдать внутриклеточных структур, таких как хлоропласты и микротрубочек в кластерных гвардии ячейки, используя Конфокальная лазерная микроскопия.
Abstract
Устьичного движение опосредует завод газового обмена, которая необходима для фотосинтеза и транспирации. Устьиц открытия и закрытия достигнуто значительное увеличение и уменьшение объема клетки гвардии, соответственно. Потому что трансфер транспорт ионов и воды происходит между гвардии клетки и крупных соседних клеток эпидермиса во время движения устьиц, расположенными распределение растений устьиц считается оптимальное распределение для устьичной движения. Экспериментальные системы нарушается расположенными шаблон устьиц полезно изучить шаблон интервалы значимости. Были определены несколько ключевых генов, связанных с расположенными устьичного распределением, и кластерный устьиц можно экспериментально вызванных изменения этих генов. В качестве альтернативы кластерных устьиц может быть также вызвана экзогенных лечения без генетических изменений. В этой статье мы описываем простой индукционной системы для кластерных устьиц в проростках Arabidopsis thaliana погружения лечение среднего раствором сахарозы содержащих. Наш метод легко и непосредственно применимо к трансгенных или мутантных линий. Хлоропластов больше представлены в качестве отличительной биологических клеток сахарозы индуцированной кластерных гвардии клеток. Кроме того представитель конфокальный микроскопических изображений корковых микротрубочек показано как пример внутриклеточных наблюдения кластерных гвардии клеток. В кластерных гвардии клетки как интервал гвардии клеток в условиях управления поддерживается радиальные ориентации корковых микротрубочек.
Introduction
Стома завод является важным органом для газового обмена для фотосинтеза и транспирации, и устьичного движение сопровождается значительные изменения в клетках гвардии через Ион driven поглощения и выпуска воды. Под микроскопом мы можем наблюдать расположенными распределение устьиц на поверхности листьев и стеблей. Считается, что этот интервал распределение устьиц помочь устьичного движение, которое регулируется обмен ионов и воды между гвардии клетки и соседних клеток эпидермиса1,2. Экспериментальный индукционной системы для кластерных устьиц полезны для расследования значение интервал распределения устьиц.
Сообщается, что пространственные кластеризации устьиц может быть вызвана генетической модификации ключевых генов для дифференциации клеток гвардии3,4 или лечение с химического соединения5. Мы также сообщали, что лечение погружения с раствором средних дополнена включая сахарозы, глюкозы, сахара и фруктоза устьичного кластеризации в семядоли Arabidopsis thaliana саженцы6. Снижение callose в новой стены клетки, разделение meristemoids и эпидермальных клеток наблюдалось в сахарозы лечение Семядоля эпидермиса, предполагая, что лечение погружения раствора сахарозы отрицательно сказывается на клеточной стенки, который предотвращает утечку и Внематочная действий ключевых генов продуктов для дифференцировки клеток гвардии (например , факторы транскрипции) направлении прилегающих эпидермальных клеток6. Аналогичный механизм было предложено от исследований по gsl8/Чор мутантов7,8. Наша экспериментальная система для воспроизводимых индукции кластерных устьиц, используя сахарозу содержащих средних решение довольно легко и дешево. Он может также использоваться для изучения внутриклеточных структур, таких как органеллы и Цитоскелет в кластерных гвардии клеток при применении к трансгенных линий, выражая флуоресцентные маркеры что лейбл внутриклеточных структур9, 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представили протоколы для индукции кластерных устьиц в A. thaliana погружения лечение среднего раствором сахарозы содержащих. Как показано здесь, этот метод очень прост и не требует специальных навыков, но может эффективно стимулировать кластерных устьиц. Более 45% клеток гвардии, о?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны профессор Сеичиро Hasezawa за его любезную поддержку нашей работы. Эта работа была поддержана грантов от японского общества для поощрения науки (JSP) KAKENHgrant насчитывает 17K 19380 и 18 H 05492, от Sumitomo фонда на грант для основных исследовательских проектов науки номер 160146 и Canon фонд предоставить т.х. Эта экспериментальная система была разработана при финансовой поддержке от числа страниц JSP KAKENHgrant 26891006 к к. а. Мы благодарим Robbie Льюис, MSc, из группы Edanz (www.edanzediting.com/ac) для редактирования черновика рукописи.
Materials
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 – 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 – 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
- Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
- Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
- Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
- Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
- Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
- Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
- Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
- Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).
