מערכת אינדוקציה מקובצים באשכולות הפיוניות על ידי סוכר פתרון טבילה טיפול בשתילי תודרנית לבנה
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא כדי להדגים כיצד לגרום הפיוניות באשכולות בפסיגי הזרע של שתילים תודרנית לבנה על ידי טיפול טבילה עם פתרון בינוני המכילים סוכר וכיצד להתבונן מבנים תאיים כגון מהכלורופלסט microtubules בתאי המשמר באשכולות באמצעות קונאפוקלית לייזר מיקרוסקופ.
Abstract
התנועה stomatal שמתווכת חילוף הגזים צמח, אשר חיוני פוטוסינתזה ועל דיות. פתיחה וסגירה stomatal מוכשרות על ידי עלייה משמעותית או להקטין את נפח התאים משמר, בהתאמה. בגלל הסעה של יונים, מים מתרחשת בין משמר תאים גדול יותר התאים באפידרמיס הסמוכים במהלך התנועה stomatal, התפלגות במרווחים של הפיוניות הצמח נחשב של התפלגות אופטימלית עבור התנועה stomatal. מערכות ניסיוני perturbing התבנית במרווחים של הפיוניות שימושיים לבחון את המשמעות של התבנית המרווח. זוהו מספר גנים מרכזיים המשויכת להתפלגות stomatal במרווחים, הפיוניות clustered יכולה להיגרם השפעול על ידי שינוי גנים אלה. לחלופין, הפיוניות clustered יכולה גם להיגרם על ידי טיפולים אקסוגני ללא שינוי גנטי. במאמר זה נתאר מערכת אינדוקציה פשוטה עבור הפיוניות באשכולות בשתילי תודרנית לבנה על ידי טיפול טבילה עם פתרון בינוני המכילים סוכרוז. השיטה שלנו היא קלה, ישירות החלים על קווים הטרנסגניים או מוטציה. מהכלורופלסט גדול מוצגים כמו סימן היכר התא הביולוגי של סוכרוז-induced תאי המשמר באשכולות. בנוסף, תמונת הנציגה מיקרוסקופיים קונאפוקלית של microtubules קורטיקלית מוצג בתור דוגמה של התבוננות תאיים תאי המשמר באשכולות. בכיוון רדיאלי microtubules קורטיקלית נשמרת בתאי המשמר באשכולות כמו תאי המשמר במרווחים בתנאי בקרה.
Introduction
סטומה רפואית הצמח הוא איבר חיוני עבור חילוף הגזים על פוטוסינתזה ועל דיות, תנועה stomatal מושגת על ידי שינויים משמעותיים בתאי המשמר דרך ספיגת מונחה יון ושחרור של מים. תחת מיקרוסקופ, ניתן להבחין דפוס הפצה במרווחים של הפיוניות של משטחי העלים והגבעולים. הפיזור במרווחים של הפיוניות נחשב כדי לעזור stomatal, תנועה מוסדר על ידי חילופי יון ומים בין תאי המשמר גובלות תאים אפידרמיס1,2. מערכות אינדוקציה ניסיוני הפיוניות באשכולות שימושיים חוקרים את החשיבות של ההתפלגות במרווחים של הפיוניות.
בעבר דווח כי קיבוץ באשכולות המרחבי של הפיוניות יכולה להיגרם על ידי שינוי גנטי של גנים מרכזיים משמר תא בידול3,4 או טיפול עם תרכובת כימית5. אנחנו גם דיווח כי טיפול טבילה עם פתרון בינוני בתוספת סוכרים כולל סוכרוז, גלוקוז, פרוקטוז גרם stomatal קיבוץ באשכולות בפסיגי הזרע של תודרנית לבנה שתילים6. Callose מופחת בקירות התא החדש הפרדת meristemoids תאים אפידרמיס נצפתה האפידרמיס cotyledon שטופלו סוכרוז, רומז כי סוכרוז פתרון טבילה טיפול משפיעה באופן שלילי על דופן התא, המונע את בריחת ו פעולה חוץ רחמי של ג’ין מפתח מוצרים עבור השומר תאית התמיינות (למשל גורמי שעתוק) לכיוון סמוכים עוריות תאים6. מנגנון דומה הוצע ממחקרים על gsl8/chor מוטציות7,8. מערכת הניסוי שלנו עבור אינדוקציה לשחזור של הפיוניות באשכולות באמצעות פתרון בינוני המכילים סוכרוז הוא די קל וזול. זה יכול לשמש גם כדי לחקור מבנים תאיים כגון organelles, את שלד התא בתאי המשמר באשכולות כאשר חל על קווים הטרנסגניים לבטא פלורסנט סמני את תווית מבנים תאיים9, 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
הוצגו פרוטוקולים עבור אינדוקציה של הפיוניות באשכולות בשתילי לבנה א על ידי טיפול טבילה עם פתרון בינוני המכילים סוכרוז. כמוצג להלן, שיטה זו היא פשוטה מאוד ולא דורש שום מיומנות מיוחדת אבל יכול לגרום ביעילות הפיוניות באשכולות. יותר מ- 45% תאי המשמר מקובצים עם 3% סוכרוז המכילות בינוני פתרון (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים על פרופסור Seiichiro Hasezawa בשל תמיכתו סוג העבודה שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן האגודה יפן KAKENHgrant של קידום המדע (JSPS) מספרים 17K 19380, 18 H. 05492, מקרן מענק לפרויקטים מחקר מדעי בסיסי Sumitomo להעניק מספר 160146, ואת קרן Canon תוצרת הארץ מערכת ניסויית זו פותחה תחת התמיכה הכספית של המספר JSPS KAKENHgrant 26891006 ק. א אנו מודים רובי לואיס, MSc, מקבוצת Edanz (www.edanzediting.com/ac) עבור עריכת טיוטה של כתב היד.
Materials
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 – 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 – 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
- Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
- Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
- Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
- Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
- Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
- Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
- Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
- Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).
