Een inductie systeem voor geclusterde stoma door suiker oplossing onderdompeling behandeling in Arabidopsis thaliana zaailingen
Summary
Het doel van dit protocol is om aan te tonen hoe voor het opwekken van geclusterde stoma in zaadlobben van Arabidopsis thaliana zaailingen door onderdompeling behandeling met een suiker-bevattende middellange oplossing en hoe waarnemen van intracellulaire structuren zoals chloroplasten en microtubuli in de geclusterde guard cellen met behulp van confocale laser microscopie.
Abstract
Stomatal verkeer bemiddelt de gasuitwisseling plant, die essentieel is voor de fotosynthese en transpiratie. Stomatal te openen en te sluiten zijn bereikt door een aanzienlijke toename en afname guard cel volume, respectievelijk. Omdat shuttle vervoer van ionen en water tussen guard cellen en grotere naburige epidermale cellen tijdens stomatal beweging plaatsvindt, hebben de verdeelde verdeling van plant stoma wordt beschouwd als een optimale verdeling voor stomatal verkeer. Experimentele systemen voor storing veroorzaakt het verdeelde patroon van stoma zijn handig voor het onderzoeken van de spatiëring patroon van betekenis. Verschillende belangrijke genen die samenhangt met de verdeelde stomatal verdeling zijn geïdentificeerd en geclusterde stoma experimenteel kunnen worden opgewekt door een wijziging van deze genen. Als alternatief, geclusterde stoma kunnen ook worden veroorzaakt door exogene behandelingen zonder genetische modificatie. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige induktie systeem voor geclusterde stoma in Arabidopsis thaliana zaailingen door onderdompeling worden behandeld als een sacharose-bevattende middellange oplossing. Onze methode is makkelijk en is rechtstreeks toepasselijk in transgene of mutant lijnen. Grotere chloroplasten worden gepresenteerd als een cel biologische keurmerk van sacharose-geïnduceerde geclusterde guard cellen. Bovendien, wordt een vertegenwoordiger van de confocal microscopische opname van corticale microtubuli weergegeven als een voorbeeld van intracellulaire observatie van geclusterde guard cellen. De radiale richting van corticale microtubuli is in geclusterde guard cellen zoals in verdeelde guard cellen in controlevoorwaarden gehandhaafd.
Introduction
De plant stoma is een essentieel orgaan voor gasuitwisseling voor fotosynthese en transpiratie en stomatal verkeer wordt bereikt door ingrijpende veranderingen in de guard cellen tot ion-gedreven opname- en release van water. Onder een Microscoop, kunnen we zien een patroon van de verdeelde distributie van stoma op de oppervlakken van bladeren en stengels. Deze verdeelde verdeling van stoma wordt beschouwd als om te helpen stomatal beweging, die wordt geregeld door ion en water uitwisseling tussen guard cellen en naburige epidermale cellen1,2. Experimentele inductie systemen voor geclusterde stoma zijn nuttig voor het onderzoek naar het belang van de verdeelde verdeling van stoma.
Er werd gemeld dat de ruimtelijke clustering van stoma kan worden opgewekt door genetische modificatie van essentiële genen voor guard cel differentiatie3,4 of behandeling met een chemisch samengestelde5. We ook gemeld dat onderdompeling behandeling met een middellange oplossing aangevuld met inbegrip van sacharose, glucose, suikers en fructose veroorzaakt stomatal clusters in de zaadlobben van Arabidopsis thaliana zaailingen6. Verminderde callose in nieuwe celwanden scheiden meristemoids en epidermale cellen in de epidermis van sacharose-behandelde zaadlob, suggereren dat sacharose oplossing onderdompeling behandeling negatief beïnvloedt de celwand, waardoor de lekkage werd waargenomen en ectopische actie van belangrijke genproducten voor guard celdifferentiatie (bijvoorbeeld transcriptiefactoren) naar aangrenzende epidermale cellen6. Een soortgelijk mechanisme werd voorgesteld van studies over gsl8/chor mutanten7,8. Onze experimenteel systeem voor reproduceerbare inductie van geclusterde stoma met behulp van sacharose-bevattende middellange oplossing is vrij eenvoudig en goedkoop. Het kan ook worden gebruikt om te onderzoeken van intracellulaire structuren zoals organellen en het cytoskelet in de geclusterde guard cellen wanneer toegepast op transgene lijnen uiten fluorescente markeringen dat etiket intracellulaire structuren9, 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protocollen voor inductie van geclusterde stoma hebben in A. thaliana zaailingen wij gepresenteerd door onderdompeling worden behandeld als een sacharose-bevattende middellange oplossing. Zoals u hier ziet, deze methode is zeer eenvoudig en vereist geen speciale vaardigheid maar efficiënt geclusterde stoma kan veroorzaken. Meer dan 45 gewichtspercenten guard cellen zijn geclusterd met 3% sucrose-bevattende middellange oplossing (gemiddelde waarden van meer dan 20 onafhankelijke waarnemingen)6<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn dankbaar aan Prof. Seiichiro Hasezawa voor zijn vriendelijke ondersteuning van ons werk. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Society van Japan voor de promotie van wetenschap (JSPS) KAKENHgrant nummers 17K 19380 en 18 H 05492, van The Sumitomo Foundation een subsidie ontvangen voor elementaire wetenschap onderzoeksprojecten nummer 160146, en de Canon Stichting T.H. toekennen Dit experimenteel systeem werd ontwikkeld onder een financiële steun van de JSPS KAKENHgrant nummer 26891006 naar K. A. Wij danken Robbie Lewis, MSc, uit Edanz groep (www.edanzediting.com/ac) voor het bewerken van een ontwerp voor van het manuscript.
Materials
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 – 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 – 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
- Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
- Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
- Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
- Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
- Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
- Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
- Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
- Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).
