Um sistema de indução de estomas agrupado por tratamento de imersão de solução de açúcar em plântulas de Arabidopsis thaliana
Summary
O objetivo do presente protocolo é demonstrar como induzir estomas clusterizadas em cotilédones de plântulas de Arabidopsis thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo açúcar e como observar estruturas intracelulares como cloroplastos e microtúbulos nas células guarda clusterizados usando confocal laser microscopia.
Abstract
Movimento estomático Medeia troca gasosa planta, que é essencial para a fotossíntese e transpiração. Estomática de abertura e fechamento são realizados por um significativo aumento e diminuição do volume das células de guarda, respectivamente. Porque o transporte de transporte de íons e água ocorre entre as células guarda e células epidérmicas vizinhas maiores durante o movimento estomático, espaçada distribuição dos estômatos da planta é considerada uma distribuição ideal para o movimento estomático. Sistemas experimentais para perturbar o espaçamento padrão dos estomas são úteis para examinar o significado do padrão de espaçamento. Foram identificados vários genes chaves associados à distribuição estomática espaçada, e estômatos em cluster podem ser induzidos experimentalmente, alterando estes genes. Alternativamente, estomas em cluster podem ser também induzidas por tratamentos exógenos sem modificação genética. Neste artigo, descrevemos um sistema simples de indução para estomas clusterizados em plântulas de Arabidopsis thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo sacarose. Nosso método é fácil e diretamente aplicável às linhas transgénicas ou mutantes. Cloroplastos maiores são apresentados como uma célula biológica marca registrada de induzida em sacarose clusterizadas células guarda. Além disso, uma imagem microscópica confocal representativa de microtúbulos corticais é mostrada como um exemplo de observação intracelular de células de guarda em cluster. A orientação radial de microtúbulos corticais é mantida nas células de guarda em cluster como em células de guarda espaçadas em controlar as condições.
Introduction
O estoma de planta é um órgão essencial para a troca de gás para a fotossíntese e a transpiração e movimento estomático é realizado por mudanças significativas nas células de guarda a íon-driven captação e liberação de água. Sob um microscópio, podemos observar um padrão de distribuição espaçada de estômatos nas superfícies das folhas e caules. Esta distribuição espaçada de estomas é considerada para ajudar o movimento estomático, que é regulamentado pela troca de íons e água entre as células guarda e vizinhos células epidérmicas1,2. Sistemas de indução experimental de estomas em cluster são úteis para investigar a importância da distribuição espaçada dos estomas.
Tem sido relatado que a aglomeração espacial dos estomas pode ser induzida por modificação genética de genes-chave de3,de diferenciação celular guarda4 ou o tratamento com um composto químico5. Também informamos que tratamento de imersão com uma solução meio suplementado com açúcares, incluindo a sacarose, glicose, e frutose causou clusters estomática em cotilédones de plântulas de Arabidopsis thaliana 6. Callose reduzida em novas paredes celulares separando meristemoids e células epidérmicas foi observada na epiderme cotilédone tratados com sacarose, sugerindo que o tratamento de imersão de solução de sacarose afeta negativamente a parede celular, que impede o escapamento e ação ectópica de produtos do gene chave para diferenciação de célula guarda (por exemplo, fatores de transcrição) em direção ao lado epidérmica células6. Um mecanismo semelhante foi sugerido de estudos sobre gsl8/chor mutantes7,8. Nosso sistema experimental para indução pode ser reproduzido dos estomas em cluster usando sacarose, contendo solução média é bastante fácil e barato. Também pode ser usada para investigar as estruturas intracelulares como organelas e o citoesqueleto nas células guarda em cluster quando aplicado às linhas transgênicas expressando marcadores fluorescentes que rótulo estruturas intracelulares9, 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós apresentamos protocolos para indução dos estomas em cluster em mudas da . thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo sacarose. Como mostrado aqui, esse método é muito simples e não requer nenhuma habilidade especializada mas eficiente pode induzir estomas em cluster. Mais de 45% das células guarda estão agrupadas com 3% de sacarose, contendo solução média (valores médios de mais de 20 observações independentes)6. Além disso, este sistema ex…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós estamos gratos ao Prof Seiichiro Hasezawa pelo seu apoio gentil do nosso trabalho. Este trabalho foi financiado por doações da sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS) KAKENHgrant números 17 19380 K e 18 H 05492, da Fundação de Sumitomo para um subsídio para projetos de pesquisa de ciência básica conceder número 160146 e a Fundação da Canon a T.H. Este sistema experimental foi desenvolvido sob um apoio financeiro do número JSPS KAKENHgrant 26891006 para K. A. Agradecemos a Robbie Lewis, MSc, do grupo de Emilia (www.edanzediting.com/ac) para a edição de um projecto do manuscrito.
Materials
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 – 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 – 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
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