Un sistema de inducción para estomas agrupadas por tratamiento de inmersión en solución de azúcar en plántulas de Arabidopsis thaliana
Summary
El objetivo de este protocolo es demostrar cómo inducir estomas agrupadas en cotiledones de plántulas de Arabidopsis thaliana mediante tratamiento de inmersión con una solución media que contienen azúcar y observar estructuras intracelulares como cloroplastos y los microtúbulos en las células de guardia agrupados con confocal laser microscopia.
Abstract
Movimiento estomático media intercambio del gas de la planta, que es esencial para la fotosíntesis y la transpiración. Apertura estomática y el cierre se logran por un aumento significativo y disminución en el volumen de la célula de guardia, respectivamente. Porque transporte transporte de iones y de agua se produce entre las células del protector y las células epidérmicas vecinas más grandes durante el movimiento estomático, la distribución espaciada de los estomas de la planta se considera una distribución óptima para el movimiento estomático. Sistemas experimentales para perturbar el patrón espaciado de estomas son útiles para examinar la importancia del patrón de espaciamiento. Se han identificado varios genes principales asociados con la distribución estomática espaciada y estomas agrupados pueden ser inducidas experimentalmente mediante la alteración de estos genes. Por otra parte, estomas agrupados pueden ser también inducidas por tratamientos exógenos sin modificación genética. En este artículo, describimos un sistema de inducción simple para estomas agrupados en Arabidopsis thaliana plántulas por tratamiento de inmersión con una solución media que contengan sacarosa. Nuestro método es fácil y directamente aplicables en líneas transgénicas o mutantes. Cloroplastos más grandes se presentan como un sello biológico celular de células de guardia agrupados inducida por sacarosa. Además, una imagen microscopio confocal representativa de los microtúbulos corticales se muestra como un ejemplo de observación intracelular de células agrupadas de guardia. Se mantiene la orientación radial de los microtúbulos corticales en agrupado células de guardia como en las células de guardia espaciadas en condiciones de control.
Introduction
El estoma de la planta es un órgano esencial para el intercambio de gases para la fotosíntesis y la transpiración, y movimiento estomático se logra por cambios significativos en las células del protector a través de la absorción de iones y la liberación de agua. Bajo el microscopio, se observa un patrón de distribución espaciada de estomas en la superficie de hojas y tallos. Esta distribución espaciada de estomas se considera a movimiento estomático, que está regulado por el intercambio de iones y agua entre las células de guardia y los vecinos de las células epidérmicas1,2. Inducción experimental para estomas de clusters son útiles para investigar la importancia de la distribución espaciada de estomas.
Se ha reportado que el agrupamiento espacial de los estomas puede ser inducida por modificación genética de los genes clave para protector de celular diferenciación3,4 o tratamiento con un compuesto químico5. También nos informan que el tratamiento de inmersión con una solución de medios complementadas con azúcares como sacarosa, glucosa, y fructosa causada agrupamiento estomático en cotiledones de plántulas de Arabidopsis thaliana 6. Reducción callosa en las paredes celulares de nuevo separar meristemoides y las células epidérmicas se observó en la epidermis de cotiledón tratado con sacarosa, lo que sugiere que el tratamiento de inmersión en solución de sacarosa afecta negativamente la pared celular, que impide la fuga y acción ectópico de productos gen clave para la diferenciación de protector de la célula (e.g. factores de transcripción) hacia el lado epidérmico células6. Un mecanismo similar fue sugerido de estudios gsl8/chor mutantes7,8. Nuestro sistema experimental para la inducción reproducible de estomas agrupados utilizando solución de medio que contiene la sacarosa es bastante fácil y barato. También puede ser utilizado para investigar las estructuras intracelulares como orgánulos y el citoesqueleto en las células de guardia agrupados cuando se aplica a líneas transgénicas expresando marcadores fluorescentes que etiqueta las estructuras intracelulares9, 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos presentado los protocolos para la inducción de estomas agrupados en a. thaliana plántulas por tratamiento de inmersión con una solución media que contengan sacarosa. Como se muestra aquí, este método es muy simple y no requiere ninguna habilidad especializada pero puede inducir eficientemente estomas agrupados. Más del 45% de las células de guarda son agrupado con 3% que contiene sacarosa solución medianas (valores promedio de más de 20 observaciones independientes)6. Por …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Prof. Seiichiro Hasezawa su amable apoyo de nuestro trabajo. Este trabajo fue financiado por donaciones de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) KAKENHgrant números 19380 K 17 y 18 H 05492, desde la Fundación de Sumitomo para una subvención para proyectos de investigación de ciencia básica otorgar número 160146 y la Fundación de Canon a T.H. Este sistema experimental fue desarrollado bajo un apoyo financiero desde el número de las páginas JSP KAKENHgrant 26891006 a K. A. Agradecemos a Robbie Lewis, MSc, de Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) para la edición de un proyecto del manuscrito.
Materials
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 – 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 – 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
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