Ein Ansaugsystem für gruppierte Spaltöffnungen durch Zucker Lösung eintauchen Behandlung in Arabidopsis Thaliana Sämlinge
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist zu zeigen, wie induzieren gruppierte Spaltöffnungen in Keimblätter von Arabidopsis Thaliana Sämlinge durch Immersion Behandlung mit einer zuckerhaltigen Lösung für mittlere und intrazelluläre Strukturen wie Chloroplasten beobachten und Mikrotubuli in der gruppierten Schließzellen mit konfokale laser-Mikroskopie.
Abstract
Stomata Bewegung vermittelt Gasaustausch Pflanze, die für die Photosynthese und Transpiration ist. Stomata öffnen und Schließen erfolgt durch eine deutliche Steigerung und Abnahme bzw. Guard Zellvolumen. Da shuttle-Transport von Ionen und Wasser während der Stomata Bewegung zwischen Schließzellen und größeren benachbarten Epidermiszellen erfolgt, gilt die Abstand Verteilung der Pflanze Spaltöffnungen eine optimale Verteilung für die Stomata Bewegung. Experimentelle Systeme für sind der Abstand Musters der Spaltöffnungen sind nützlich, um den Abstand Muster Bedeutung zu prüfen. Mehrere wichtige Gene verbunden mit dem Abstand Stomata Vertrieb wurden identifiziert und gruppierte Spaltöffnungen experimentell durch die Veränderung dieser Gene induziert werden können. Gruppierte Spaltöffnungen können alternativ auch durch exogene Behandlungen ohne gentechnische Veränderung induziert werden. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache Induktionssystem für gruppierte Spaltöffnungen in Arabidopsis Thaliana Sämlinge durch Immersion Behandlung mit einer Saccharose-haltige Mittel Lösung. Unsere Methode ist einfach und unmittelbar zu transgenen oder mutierten Linien. Größere Chloroplasten werden als biologische Zelle Markenzeichen der Saccharose-induzierte gruppierten Schließzellen vorgestellt. Darüber hinaus ist ein repräsentatives konfokale mikroskopische Bild der kortikalen Mikrotubuli der intrazellulären Beobachtung von gruppierten Schließzellen exemplarisch dargestellt. Die radiale Ausrichtung der kortikalen Mikrotubuli wird in gruppierten Schließzellen wie angeordneten Schließzellen in Kontrolle Bedingungen beibehalten.
Introduction
Die Pflanze Stoma ist ein wesentliches Organ für Gasaustausch für Photosynthese und Transpiration und Stomata Bewegung wird durch Veränderungen im Schließzellen durch Ionen-gesteuerte Aufnahme und Abgabe von Wasser erreicht. Unter dem Mikroskop können wir beobachten, ein Abstand Verteilungsmuster von Spaltöffnungen auf der Oberfläche der Blätter und Stängel. Dieser Abstand Verteilung der Spaltöffnungen wird als Stomata Bewegung helfen, die von Wasser und Ionen-Austausch zwischen den Schließzellen und den angrenzenden Epidermiszellen1,2geregelt ist. Experimentellen Induktion Systeme für gruppierte Spaltöffnungen eignen sich für die Untersuchung der Bedeutung der Abstand Verteilung der Spaltöffnungen.
Es wurde berichtet, dass räumliche Bündelung von Spaltöffnungen durch gentechnische Veränderung von Schlüsselgene für Guard Zelle Differenzierung3,4 oder Behandlung mit einer chemischen Verbindung5induziert werden kann. Wir haben auch berichtet, dass Immersion Behandlung mit einer mittleren Lösung mit Zucker Saccharose, Glukose, einschließlich ergänzt und Fruktose verursacht Stomata clustering in Keimblätter von Arabidopsis Thaliana Sämlinge6. Reduzierte Kallose in neue Zellwänden, die Trennung von Meristemoids und Epidermiszellen beobachtet in der Saccharose behandelt Keimblattes Epidermis, was darauf hindeutet, dass Saccharose Lösung eintauchen Behandlung wirkt sich negativ auf die Zellwand, die verhindert das Auslaufen und ektopische Wirkung der Schlüssel-Genprodukte für Guard-Zell-Differenzierung (z. B. Transkriptionsfaktoren) gegenüber angrenzenden epidermalen Zellen6. Ein ähnlicher Mechanismus wurde von Studien über die gsl8/Chor Mutanten7,8vorgeschlagen. Unsere Experimentiersystem für reproduzierbare Induktion von gruppierten Spaltöffnungen mit Saccharose-haltige Mittel Lösung ist ganz einfach und billig. Es kann auch verwendet werden, zu untersuchen, intrazelluläre Strukturen wie Organellen und dem Zytoskelett in die gruppierten Schließzellen bei transgenen Linien mit dem Ausdruck fluoreszierenden Marker, dass Label intrazellulären Strukturen9, 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben Protokolle für die Induktion von gruppierten Spaltöffnungen in A. Thaliana Sämlinge durch Immersion Behandlung mit einer Saccharose-haltige Mittel Lösung vorgelegt. Wie hier gezeigt, diese Methode ist sehr einfach und erfordert keine spezielle Fähigkeit aber effizient gruppierte Spaltöffnungen induzieren kann. Mehr als 45 % der Schließzellen sind mit 3 % Saccharose-haltige Cluster mittlere Lösung (Mittelwerte von mehr als 20 unabhängige Beobachtungen)6. Darüber hinaus …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, Prof. Seiichiro Hasezawa für seine freundliche Unterstützung unserer Arbeit. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der Japan Society unterstützt, für die Promotion of Science (JSPS) KAKENHgrant 17K 19380 Zahlen und 18 H 05492, der Sumitomo-Foundation für einen Zuschuss für grundlegende Wissenschaft Forschungsprojekte, Anzahl 160146 und die Canon Foundation t.h gewähren. Dieses experimentelle System wurde unter eine finanzielle Unterstützung von der JSPS KAKENHgrant Nummer 26891006, K. A. entwickelt. Wir bedanken uns bei Robbie Lewis, MSc, aus Edanz Gruppe (www.edanzediting.com/ac) für die Bearbeitung eines Entwurfs des Manuskripts.
Materials
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 – 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 – 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
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