Poliomavirus de células de Merkel la infección y la detección
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para infectar fibroblastos dérmicos humanos primarios con MCPyV. El protocolo incluye aislamiento de fibroblastos dérmicos, preparación de viriones MCPyV, infección por el virus, tinción de inmunofluorescencia y fluorescencia hibridación in situ. Este protocolo puede ampliarse para caracterizar las interacciones MCPyV-host y descubrir otros tipos de células infectables por MCPyV.
Abstract
Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infección puede conducir al carcinoma de la célula de Merkel (MCC), una forma altamente agresiva de cáncer de piel. Estudio de mecanismos para investigar completamente MCPyV molecular biología y mecanismos oncogénicos ha visto obstaculizado por la falta de modelos de cultivo celular adecuado. Aquí, describimos un conjunto de protocolos para realizar y detectar MCPyV la infección de células de piel humana primaria. Los protocolos describen el aislamiento de los fibroblastos dérmicos humanos, preparación de viriones recombinantes de MCPyV y la detección de infección por el virus por tinción de inmunofluorescencia (IF) y in situ hibridación de ADN reacción en cadena (HCR), que es muy sensible fluorescencia en el enfoque de situ del hibridación (pescado). Los protocolos en este documento pueden ser adaptados por los investigadores interesados a identificar otros tipos de células o líneas celulares compatibles con infección MCPyV. El enfoque descrito de pescado también podría adaptarse para detectar bajos niveles de ADN viral presente en la piel humana infectada.
Introduction
Polyomavirus de la célula de Merkel (MCPyV) es un virus ADN pequeño, doble hebra que se ha asociado con un cáncer de piel raro pero agresivo, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. La tasa de mortalidad de MCC, alrededor del 33%, supera la de melanoma3,4. MCPyV tiene un genoma circular de ~ 5 kb1,5 atravesada por una región reguladora no codificante (NCRR) en regiones1codificación de temprano y tarde. El NCRR contiene el origen viral de replicación (Ori) y de bidireccional promotores de transcripción viral6,7. La región temprana codifica proteínas de antígeno de tumor llamadas grandes T (LT), pequeño T (sT), 57kT, alternativa LT ORF (ALTO), así como una hay miRNA1,8,9,10. La región tardía codifica las proteínas de la cápside VP1 y VP211,12,13. LT y sT son las proteínas de MCPyV mejor estudiadas y han demostrado para apoyar la replicación de ADN viral y la tumorigénesis inducida por MCPyV5. Integración clonal de MCPyV ADN en el genoma del anfitrión, que se ha observado en hasta un 80% de la MCC, es probablemente un factor causal para tumor virus-positivo de desarrollo14,15.
La incidencia de CCM se ha triplicado en los últimos veinte años16. MCPyV la infección asintomática también es generalizada en la población general de18,17,19. Con el creciente número de diagnósticos MCC y la alta prevalencia de infección por MCPyV, hay una necesidad de mejorar nuestra comprensión del virus y su potencial oncogénico. Sin embargo, muchos aspectos de la biología MCPyV y mecanismos oncogénicos siguen siendo mal entendidos20. Esto es en gran parte porque MCPyV mal se replica en células establecidas líneas11,12,21,,,2223 y, hasta hace poco, la piel las células capaces de soportar MCPyV la infección no había sido descubierto22. Estudio de mecanismos para investigar completamente MCPyV y su interacción con las células huésped se ha visto obstaculizado por la falta de sistema de cultivo de células para propagar el virus5.
Hemos descubierto que fibroblastos dérmicos humanos primarios (HDFs) aislaron de prepucio humano neonatal soporte robusto MCPyV la infección tanto en vitro y ex vivo24. De este estudio, estableció el primer modelo de infección de cultura celular MCPyV24. Basándose en este modelo de sistema, demostró que la inducción de genes de matriz metaloproteinasa (MMP) por la WNT/β-catenina señalización de vía y otros factores de crecimiento estimula la infección MCPyV. Por otra parte, encontramos que el aprobado por la FDA MEK antagonista trametinib impide eficazmente la infección de MCPyV5,25. De estos estudios, también establecimos un conjunto de protocolos para el aislamiento de los fibroblastos dérmicos humanos24,25, preparación MCPyV viriones11,12, realizar la infección MCPyV en fibroblastos dérmicos humanos 24 , detección de MCPyV de proteínas por tinción IF26y 25 . Además, adaptamos la in situ ADN hibridación la reacción en cadena (HCR) tecnología27 para desarrollar una técnica altamente sensible de pescado (HCR-DNA FISH) para la detección de ADN MCPyV en las células infectadas de la piel humana. Estos nuevos métodos serán útiles para estudiar el ciclo infeccioso de MCPyV, así como la respuesta celular a la infección por MCPyV. Las células de depósito de huéspedes naturales que mantienen la infección MCPyV y las células que dan origen a tumores MCC sigue siendo desconocidas. Las técnicas que describimos en este manuscrito podrían aplicarse para examinar varios tipos de células humanas para identificar tanto las células de depósito y el origen de tumores MCC. Nuestros métodos establecidos, tales como pescados de HCR-DNA, también podrían ser empleados en la detección de otros virus ADN de tumor y la caracterización de las interacciones de la célula huésped.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos descritos arriba, incluyendo el aislamiento de fibroblastos dérmicos de tejido de la piel humana, preparación de viriones recombinantes de MCPyV, infección de las células cultivadas, coloración inmunofluorescente y un método sensible de peces adaptado de tecnología HCR, que debe permitir a los investigadores a analizar MCPyV infección27. Uno de los pasos más críticos para lograr MCPyV infección in vitro es la producción de preparaciones de virus de alto título. Utilizando…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Meenhard Herlyn (Instituto de Wistar) y el Dr. M. Celeste Simón (Universidad de Pennsylvania) reactivos y apoyo técnico. También agradecemos a los miembros de nuestros laboratorios de discusión útil. Este trabajo fue apoyado por las donaciones de institutos nacionales de salud (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 y R01CA142723), la beca de apoyo de centro NCI cáncer (NCI P30 CA016520) y el premio Penn CFAR (P30 AI 045008).
Materials
| Fetal calf serum | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamine |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG-200 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Store at -80 degree celsius |
| Collagenase type IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Protect from light |
| DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Protect from light |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Protect from light |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | Protect from light |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Lot # B2717 |
| MCV VP1 rabbit | Rabbit polyclonal serum #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant | Corning | 354060 | Store at -80 degree celsius |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
| Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase | EPICENTRE | E3101K | |
| Probe hybridization buffer | Molecular technologies | ||
| Probe wash buffer | Molecular technologies | ||
| Amplification buffer | Molecular technologies | ||
| Alexa 594-labeled hairpins | Molecular technologies | B4 | Protect from light |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Buffer PB | Qiagen | 19066 | |
| blue miniprep spin column | Qiagen | 27104 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| T4 ligase | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
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