JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Merkel Hücresi Polyomavirus enfeksiyon ve algılama

Published: February 07, 2019
doi:
10.3791/58950
, , ,
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology,National Cancer Institute

Summary

Burada, MCPyV ile birincil insan dermal fibroblast bulaştırmak için bir protokol mevcut. Protokol dermal fibroblastlar izolasyonu, MCPyV virions, virüs enfeksiyonu, ayirt boyama ve floresan hazırlanması in situ hibridizasyon içerir. Bu iletişim kuralı tarafından MCPyV MCPyV ana bilgisayar etkileşimleri karakterize ve diğer hücre tipleri infectable keşfetmek için genişletilebilir.

Abstract

Merkel hücre polyomavirus (MCPyV) enfeksiyon Merkel Hücresi Karsinomu (MCC), cilt kanseri son derece saldırgan bir tür için yol açabilir. MCPyV moleküler biyoloji ve oncogenic mekanizmaları tam olarak araştırmak için mekanik çalışmaları yeterli hücre kültür modellerin eksikliği tarafından engel olmuştur. Burada, biz gerçekleştirmek ve birincil insan deri hücrelerinin MCPyV enfeksiyon tespit iletişim kuralları kümesi tanımlamak. İletişim kuralları insan dermal fibroblastlar, izolasyonu rekombinant MCPyV virions hazırlanması ve virüs enfeksiyonu tespiti immünfloresan (Eğer) boyama ve in situ olarak DNA hibridizasyon son derece hassas olan zincirleme (HCR), tarafından tarif floresans in situ hibridizasyon (balık) yaklaşım. İletişim kuralları burada baktılar araştırmacılar tarafından diğer hücre tipleri veya MCPyV enfeksiyon destek hücre satırları tanımlamak için adapte edilebilir. Tarif Balık yaklaşım da viral DNA’lar enfekte insan deride mevcut seviyesinin düşük algılamak için adapte.

Introduction

Merkel hücre polyomavirus (MCPyV) küçük, Çift iplikçikli DNA virüsü bir nadir ama sert cilt kanseri, Merkel Hücresi Karsinomu (mm)1,2ilişkilendirilmiş olduğunu. MM, yaklaşık % 33, ölüm oranı Melanom3,4süresini aşıyor. MCPyV ~ 5 kb1,5 erken ve geç bölgeler1kodlama içine bir kodlama-düzenleyici bölgeye göre (NCRR) böldüğü dairesel genom vardır. NCRR çoğaltma (Ori) ve çift yönlü Rehberleri viral transkripsiyon6,7için viral kökenli içerir. Erken bölge büyük T (LT), küçük T (sT), 57kT, alternatif LT ORF (ALTO) yanı sıra autoregulatory miRNA1,8,9,10denilen tümör antijen protein kodlayan. Geç bölge kapsid protein VP1 ve VP211,12,13kodlar. LT ve sT en çok çalışılan MCPyV proteinler ve viral DNA ikileşmesi ve MCPyV kaynaklı tumorigenesis5desteklemek için göstermiştir. Klonal entegrasyon MCCs ilâ % 80 gözlenmiştir, ana bilgisayar genom MCPyV DNA’ın olası virüs-pozitif tümör geliştirme14,15nedensel bir faktördür.

MM insidansı üzerinde son yirmi yıl16kat arttı. Asemptomatik MCPyV enfeksiyon genel nüfus17,18,19‘ da yaygındır. MM tanılar sayısının artması ve MCPyV enfeksiyon yüksek yaygınlığı ile virüs ve oncogenic bir potansiyel anlayışımızı geliştirmek için gerek yoktur. Ancak, MCPyV biyoloji ve oncogenic mekanizmaları birçok açıdan kötü anlaşılan20kalır. Büyük ölçüde MCPyV kötü içinde kurulan hücre satırlar11,12,21,22,23 çoğaltır ve yakın zamana kadar MCPyV destekleme kapasitesine sahip hücreleri cilt, bunun nedeni enfeksiyon keşfedilen22olmasaydı. Tam olarak MCPyV ve konak hücreleri ile etkileşimi araştırmak için mekanik çalışmaları5virüs yayma için hücre kültür sistemi eksikliği ile engel olmuştur.

Biz birincil insan dermal fibroblastlar (HDFs) her iki vitro yenidoğan insan sünnet destek sağlam MCPyV enfeksiyondan izole keşfetti ve ex vivo24. Bu çalışmada, ilk hücre kültür enfeksiyon modeli MCPyV24için kurduk. Bu modeli sistemde bina, matriks metalloproteinaz (MMP) genler tarafından WNT/β-catenin yolu ve diğer büyüme faktörleri sinyal indüksiyon MCPyV enfeksiyon uyarır gösterdi. Ayrıca, FDA onaylı MEK antagonisti trametinib etkili MCPyV enfeksiyon5,25engeller bulduk. Bu çalışmalardan da insan dermal fibroblastlar24,25, izole için iletişim kuralları kümesi MCPyV virions11,12, MCPyV enfeksiyon üzerinde insan dermal fibroblastlar performans hazırlama kurduk 24 , 25 ve algılama MCPyV proteinler tarafından Eğer boyama26. Buna ek olarak, enfekte insan deri hücrelerinde MCPyV DNA’sı tespit için son derece hassas bir balık tekniği (HCR-DNA balık) geliştirmek için yerinde DNA hibridizasyon zincirleme reaksiyon (HCR) teknoloji27 uyarlanmış. Yeni yöntemlerin MCPyV hem de hücresel yanıt MCPyV enfeksiyon bulaşıcı döngüsü eğitimi için faydalı olacaktır. MCPyV enfeksiyon korumak doğal ana depo hücreleri ve mm tümörü ortaya çıkmasına hücreleri bilinmeyen kalır. Biz bu el yazması tarif teknikleri hem rezervuar hücreleri tanımlamak için insan hücreleri türleri ve MCC tümörler kökeni incelemek için uygulanabilir. HCR-DNA balık gibi bizim kurulan yöntemleri de diğer DNA tümör virüs tespiti ve konak hücre etkileşimleri karakterizasyonu istihdam olabilir.

Protocol

İnsan yenidoğan foreskins Penn cilt hastalığı araştırma Merkezi’nden elde edilmiştir. Yetişkin insan fibroblast ameliyattan sonra atılan normal deriden elde edilmiştir. Tüm iletişim kuralları University of Pennsylvania Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından kabul edildi. 1. insan dermal fibroblastlar yalıtım İnsan yenidoğan sünnet derisi yağ ve subkutan doku kapalı trim ve yarım veya çeyrek deri örneği kesmek için bir makas kullanın. 5 mL 10…

Representative Results

Bu el yazması açıklanan protokol yalıtım HDFs (Şekil 1) neredeyse homojen bir nüfusun izin. İmmünfloresan boyama tarafından gösterildiği gibi neredeyse % 100 insan deri hücreleri izole bu iletişim kuralında tanımlanan koşullara olumlu kullandığınız lekeli dermal fibroblast işaretleri, vimentin ve kollajen için ben24, ama insan için olumsuz sünnet derisi keratinosit marker K14 (Şekil 1</str…

Discussion

İnsan cilt dokusundan dermal fibroblastlar yalıtım, rekombinant MCPyV virions hazırlanması, enfeksiyon kültürlü hücreleri, immünfloresan boyama ve HCR teknolojisinden adapte hassas bir balık yöntemi de dahil olmak üzere yukarıda açıklanan yöntemleri hangi Araştırmacılar MCPyV enfeksiyon27analiz etmek etkinleştirmeniz gerekir. MCPyV enfeksiyon tüp bebek ulaşmada en önemli adımlardan biri yüksek titresi virion hazırlıklar yapımıdır. İstimal belgili tanımlık protokol…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Enstitüsü) ve Dr. M. Celeste Simon (Pennsylvania Üniversitesi) reaktifler ve teknik destek sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Laboratuarlarımızda yararlı tartışma için üyeleri ayrıca teşekkür ederiz. Bu eser ulusal kurumları sağlık (NIH) hibe (R01CA187718, R01CA148768 ve R01CA142723), ncı Kanser Merkezi Destek Grant (ncı P30 CA016520) ve Penn CFAR Ödülü (P30 AI 045008) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. . Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018)
  30. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018)
  31. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018)

Tags

Merkel Cell PolyomavirusMCPyVCell Culture ModelDermal FibroblastsVirus IsolationImmunofluorescent StainingFluorescent In Situ HybridizationInfectious CycleHost Cell Interactions293TT28 CellsTransfectionST ExpressionLT Expression

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image