JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Polyomavirus מרקל זיהום וזיהוי

Published: February 07, 2019
doi:
10.3791/58950
, , ,
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology,National Cancer Institute

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להדביק את ראשי פיברובלסט עורי האנושי עם MCPyV. הפרוטוקול כולל בידוד של fibroblasts עורי, הכנה של MCPyV virions, זיהום בנגיף, immunofluorescence מכתים פלורסצנטיות הכלאה באתרו. פרוטוקול זה ניתן להאריך אפיון אינטראקציות MCPyV-מארח, גילוי סוגי תאים אחרים מרישי על-ידי MCPyV.

Abstract

מרקל תא polyomavirus (MCPyV) זיהום יכול להוביל מרקל קרצינומה של תאים (MCC), טופס אגרסיבי ביותר של סרטן העור. מחקרים מכניסטית מחקירה מלאה של ביולוגיה מולקולרית MCPyV ומנגנונים oncogenic יש כבר הקשו על ידי חוסר מודלים תרבות תא נאותה. כאן, אנו מתארים את ערכה של פרוטוקולים עבור ביצוע וכן זיהוי זיהום MCPyV של תאי העור האנושי העיקרי. הפרוטוקולים לתאר את ניתוקה של האדם fibroblasts עורי, הכנת virions MCPyV רקומביננטי, וזיהוי להידבקות בווירוס על ידי צביעת (אם) immunofluorescent והן באתרו DNA-הכלאה תגובת שרשרת (HCR), אשר הוא מאוד רגיש קרינה פלואורסצנטית בגישה הכלאה (דגים) באתרו. ניתן להתאים את הפרוטוקולים במסמך זה על ידי חוקרים מעוניין לזהות סוגי תאים או שורות תאים התומכים MCPyV זיהום אחרים. הגישה דגים שתואר יכול להתאים גם לגילוי רמות נמוכות של נגיפי DNAs המצויים בעור האדם הנגוע.

Introduction

מרקל תא polyomavirus (MCPyV) הוא קטן, כפול גדילי DNA וירוס שויך סרטן העור נדירה אך אגרסיבי, מרקל תא קרצינומה (MCC)1,2. שיעור התמותה של מפקד צוות משימה, בסביבות 33%, חורג של מלנומה3,4. MCPyV יש גנום מעגלית של1,~ 5 kb5 נחצה על ידי אזור תקינה ללא קידוד (NCRR) לתוך מוקדם ולא מאוחר קידוד אזורים1. NCRR מכיל מקור ויראליות שכפול (אורי) ועל היזמים דו-כיווניים עבור שעתוק ויראלי6,7. האזור בתחילת מקודד הגידול אנטיגן חלבונים הנקראים T גדול (LT), T קטן (רח’), 57kT, ORF LT חלופי (ALTO), כמו גם של autoregulatory miRNA1,8,9,10. האזור מאוחר מקודד את החלבונים capsid VP1 ואת VP211,12,13. LT ו- sT החלבונים MCPyV ביותר למד, הוכחו תומכת שכפול ה-DNA ויראלי הנוצרות על-ידי MCPyV tumorigenesis5. שילוב המשובטים MCPyV DNA הגנום המארח, אשר נצפתה עד 80% של MCCs, הוא כנראה גורם סיבתי עבור גידול חיובי וירוס פיתוח14,15.

השכיחות של MCC שילש מעל ה-20 שנה האחרונות16. זיהום MCPyV אסימפטומטיים נפוצה גם האוכלוסייה הכללית17,18,19. עם הגדלת מספר אבחנות MCC, שכיחות גבוהה של זיהום MCPyV, יש צורך לשפר את ההבנה שלנו של הווירוס, פוטנציאל oncogenic שלו. עם זאת, היבטים רבים של ביולוגיה MCPyV ומנגנונים oncogenic נשארים ממעטים להבין20. זאת בעיקר משום MCPyV משכפל לקוי תא הוקמה קווים11,12,21,22,23 , עד לאחרונה, מסוגל לתמוך MCPyV תאי עור זיהום לא היה שהתגלו22. מחקרים מכניסטית לחקור באופן מלא MCPyV והאינטראקציה שלו עם התאים המארחים יש להיות הכבידו על ידי חוסר תא מערכת תרבות להפצת וירוסים5.

גילינו כי ראשי האדם עורי fibroblasts (HDFs) מבודד מן העורלה האנושי neonatal תמיכה איתנה MCPyV זיהום בשני במבחנה ו- ex-vivo24. ממחקר זה, הקמנו המודל זיהום התרבות התא הראשון עבור MCPyV24. בונים על מערכת זו מודל, הראנו תנאי הגיוס של מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (MMP) גנים מאת חגיגת/β-catenin איתות לשביל וגורמים אחרים הצמיחה מגרה זיהום MCPyV. יתר על כן, מצאנו trametinib אנטגוניסט MEK שאושרו על-ידי ה-FDA מעכב ביעילות MCPyV זיהום5,25. ממחקרים אלה, גם הקמנו קבוצה של פרוטוקולים לבידוד fibroblasts עורי אנושי24,25, הכנת MCPyV virions11,12, ביצוע זיהום MCPyV על האדם fibroblasts עורי 24 , 25 וגילוי חלבונים MCPyV אם צביעת26. בנוסף, התאמנו באתרו DNA הכלאה תגובת שרשרת (HCR) טכנולוגיה27 לפתח טכניקה דגים רגישים (דגים HCR-DNA) לגילוי MCPyV DNA בתאים נגועים העור האנושי. שיטות חדשות אלה יהיה מועיל ללימוד מחזור זיהומית של MCPyV, כמו גם התגובה התאית זיהום MCPyV. התאים מאגר טבעי מארח לשמור על זיהום MCPyV והתאים להצמיח גידולים MCC נשאר לא ידוע. טכניקות שנתאר כתב יד זה יכול להיות מיושם לבחון סוגים שונים של תאים אנושיים כדי לזהות גם את המאגר התאים ואת המקור של גידולים MCC. השיטות שלנו הוקמה, כגון דגים HCR-DNA, יכול גם להיות מועסק זיהוי וירוסים גידול אחרים ה-DNA, אפיון אינטראקציות התא המארח.

Protocol

. אל תדאג neonatal האנושי התקבלו ממרכז המחקר של מחלת העור פן. למבוגרים fibroblasts אנושי, התקבלו שהושלכו עור רגיל לאחר הניתוח. כל הפרוטוקולים אושרו על ידי אוניברסיטת פנסילבניה מוסדיים המנהלים. 1. בידוד של האדם fibroblasts עורי השתמש זוג מספריים כדי לקצץ את רקמת שומן ו התת-עורית מן הערל?…

Representative Results

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מותר בידוד של אוכלוסיה הומוגנית כמעט של HDFs (איור 1). כפי שמתואר על ידי צביעת immunofluorescent, כמעט 100% של תאים אנושיים עורי מבודדים באמצעות התנאים המתוארים פרוטוקול זה היו באופן חיובי צבעונית פיברובלסט עורי סמנים, vimentin של קולגן אני<sup clas…

Discussion

השיטות המתוארות לעיל, לרבות בידוד של עורי fibroblasts מרקמות העור האנושי, הכנת virions MCPyV רקומביננטי, זיהום של תאים בתרבית, צביעת immunofluorescent, שיטה דגים רגישים הותאם מהטכנולוגיה נציבות האו ם לפליטים, אשר צריך לאפשר לחוקרים לנתח זיהום MCPyV27. אחד השלבים הקריטיים ביותר להשגת MCPyV זיהום במבחנה …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות ד ר Meenhard Herlyn (מכון Wistar), ד ר מ. סלסט סימון (אוניברסיטת פנסילבניה) לאספקת ריאגנטים ותמיכה טכנית. אנו מודים גם אנשי מעבדות שלנו לדיון מועיל. עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הלאומית המכונים לבריאות (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 ו- R01CA142723), המענק תמיכה במרכז לסרטן (NCI P30 CA016520) NCI, ופרס וכפר פן (P30 AI 045008).

Materials

Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. . Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018)
  30. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018)
  31. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018)

Tags

Merkel Cell PolyomavirusMCPyVCell Culture ModelDermal FibroblastsVirus IsolationImmunofluorescent StainingFluorescent In Situ HybridizationInfectious CycleHost Cell Interactions293TT28 CellsTransfectionST ExpressionLT Expression

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image