JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

بوليومافيروس خلية ميركل العدوى والكشف

Published: February 07, 2019
doi:
10.3791/58950
, , ,
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology,National Cancer Institute

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لتصيب الابتدائي تنتجها من الخلايا الجلدية البشرية الليفية مع MCPyV. يشمل البروتوكول عزل الخلايا الليفية الجلدية، وإعداد فيريونس MCPyV والإصابة بعدوى الفيروس، وتلطيخ الفلورة والأسفار في التهجين الموقعي. ويمكن تمديد هذا البروتوكول وصف التفاعلات MCPyV-المضيف واكتشاف أنواع الخلايا الأخرى إينفيكتابل ب MCPyV.

Abstract

يمكن أن تؤدي الإصابة polyomavirus (MCPyV) خلية ميركل إلى ميركل سرطان الخلية (MCC)، أحد أشكال سرطان الجلد شديدة عدوانية. الدراسات الميكانيكية إجراء تحقيقات كاملة في البيولوجيا الجزيئية MCPyV وآليات النمطان أعيقت بعدم وجود نماذج ثقافة الخلية الملائمة. وهنا يصف لنا مجموعة من البروتوكولات لأداء، واكتشاف الإصابة MCPyV خلايا الجلد البشرية الأساسية. وصف البروتوكولات عزلة الليفية الجلدية البشرية، إعداد فيريونس MCPyV المؤتلف، والكشف عن الإصابة بالفيروس تلطيخ (إذا كان) إيممونوفلوريسسينت وفي الموقع التهجين الحمض النووي سلسلة من ردود الفعل (HCR)، التي هي درجة عالية من الحساسية الأسفار في نهج الموقع التهجين (الأسماك). يمكن تكييفها مع البروتوكولات الملحقة هذه الوثيقة من الباحثين المهتمين التعرف على أنواع الخلايا أو خطوط الخلايا التي تدعم MCPyV العدوى الأخرى. وصف نهج الأسماك يمكن تكييفها أيضا للكشف عن مستويات منخفضة من السلطات الوطنية المعينة موجودة في جلد الإنسان المصابة الفيروسية.

Introduction

ميركل خلية polyomavirus (MCPyV) هو فيروس الحمض النووي الصغيرة، مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل التي تم إقرانها مع سرطان جلد نادرة ولكن العدوانية، ميركل الخلية الكبدية (MCC)1،2. يتجاوز معدل الوفيات من لجنة التنسيق الإداري، حوالي 33%، سرطان الجلد3،4. وقد MCPyV جينوم دائرية ~ 5 كيلو بايت1،5 جزئين حسب منطقة تنظيمية غير الترميز (نكر) في أوائل وأواخر ترميز المناطق1. نكر يحتوي على أصل الفيروسية النسخ المتماثل (أوري) والمروجين ثنائي الاتجاه للنسخ الفيروسي6،7. المنطقة أوائل يشفر البروتينات مستضد ورم دعا كبير تي (LT)، تي الصغيرة (ش)، 57kT، ORF الملازم البديلة (ألتو)، فضلا عن أوتوريجولاتوري ميرنا1،،من89،10. ترميز المنطقة أواخر بروتينات قفيصه VP1 و VP211،،من1213. الملازم وشارع البروتينات MCPyV أفضل درس وأظهرت دعما لتكرار الحمض النووي الفيروسي والمستحثه MCPyV tumorigenesis5. ومن المرجح الاستنساخ إدماج MCPyV الدنا في الجينوم المضيفة، وقد لوحظ في تصل إلى 80 في المائة من مراكز مراقبة الرحلات، عاملاً سببياً للمصابات بفيروس الورم التنمية14،15.

حالات الإصابة بلجنة التنسيق الإداري ثلاثة إضعاف على مدى السنوات العشرين الماضية16. أعراض الإصابة MCPyV أيضا على نطاق واسع في عموم السكان17،،من1819. مع تزايد عدد التشخيصات لجنة التنسيق الإداري وتفشي العدوى MCPyV، هناك حاجة إلى تحسين فهمنا للفيروس وإمكاناتها النمطان. ومع ذلك، يظل العديد من جوانب البيولوجيا MCPyV وآليات النمطان غير مفهومة20. هذا إلى حد كبير لأن MCPyV يتطابق سيئة في الخلية أنشئت خطوط11،12،21،،من2223 ، وحتى وقت قريب، خلايا قادرة على دعم MCPyV الجلد ولم تكن الإصابة اكتشفت22. قد عرقلت الدراسات الميكانيكية للتحقيق الكامل MCPyV وتفاعلها مع الخلايا المضيفة بالافتقار إلى نظام الثقافة خلية لنشر الفيروسات5.

فقد اكتشفنا أن الليفية الجلدية البشرية الأولية (هي) المعزولة من القلفة البشرية الولدان دعم قوي MCPyV العدوى على حد سواء في المختبر و السابقين فيفو24. من هذه الدراسة، قمنا بإنشاء أول خلية ثقافة العدوى نموذج MCPyV24. وبناء على هذا النظام النموذجي، واظهرنا أن استحثاث جينات أية (MMP) مصفوفة من WNT/بيتا-كاتينين إشارات الطريق وغيرها من عوامل النمو يحفز الإصابة MCPyV. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن تراميتينيب خصم مجاهدي خلق التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير يعوق فعالية MCPyV العدوى5،25. من هذه الدراسات، كما أنشأنا مجموعة من البروتوكولات لعزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية24،25، إعداد MCPyV فيريونس11،12، أداء MCPyV العدوى في الخلايا الليفية الجلد البشري 24 , 25 وكشف MCPyV البروتينات التي إذا المصبوغة26. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تكييفها في الموقع الحمض النووي التهجين سلسلة من ردود الفعل (HCR) التكنولوجيا27 لتطوير تقنية أسماك حساسة للغاية (HCR-الحمض النووي الأسماك) للكشف عن MCPyV الحمض النووي في خلايا الجلد البشرية المصابة. هذه الأساليب الجديدة سوف تكون مفيدة لدراسة دورة المعدية MCPyV، فضلا عن الاستجابة الخلوية للإصابة MCPyV. الخلايا الخزان المضيفة الطبيعية التي تحافظ على العدوى MCPyV والخلايا التي تؤدي إلى أورام لجنة التنسيق الإداري ما زال مجهولاً. يمكن تطبيق التقنيات يصف لنا في هذه المخطوطة دراسة أنواع مختلفة من الخلايا البشرية لتحديد الخلايا الخزان ومنشأ الأورام لجنة التنسيق الإداري. يمكن أيضا استخدام اساليبنا المتبعة، مثل “الأسماك” HCR-الحمض النووي، وفي الكشف عن فيروسات الورم الحمض النووي الأخرى ووصف التفاعلات الخلية المضيفة.

Protocol

وتم الحصول على فوريسكينس حديثي الولادة البشرية من مركز أبحاث الأمراض الجلدية بنسلفانيا. تم الحصول على الكبار الليفية البشرية من التخلص من الجلد الطبيعي بعد الجراحة. ووافق جميع البروتوكولات الملحقة بجامعة “بنسلفانيا مجلس المراجعة المؤسسية”. 1-عزل الخلايا الليفية الجلد البشر…

Representative Results

يسمح البروتوكول، المذكورة في هذه المخطوطة عزلة السكان متجانسة تقريبا من هي (الشكل 1). كما يتبين من تلطيخ إيمونوفلوريسسينت، تقريبا 100% من الخلايا الجلدية البشرية المعزولة باستخدام الشروط الموصوفة في هذا البروتوكول كان إيجابيا الملون لعلامات جلدية تنتجها ?…

Discussion

الأساليب المذكورة أعلاه، بما في ذلك عزل الخلايا الليفية الجلد من أنسجة جلد الإنسان، إعداد المؤتلف MCPyV فيريونس، وعدوى الخلايا المستزرعة وتلطيخ إيمونوفلوريسسينت، وأسلوب أسماك حساسة مقتبس من HCR التكنولوجيا، التي وينبغي أن تمكن الباحثين من تحليل MCPyV العدوى27. إحدى الخطوات الأكث?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلف يود أن يشكر الدكتور مينارد هيرلين (معهد ويستار) والدكتور م. سيليست سيمون (جامعة بنسلفانيا) لتوفير الكواشف والدعم التقني. كما نشكر أعضاء مختبراتنا لمناقشة مفيدة. وكان يدعمها هذا العمل منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (R01CA187718 و R01CA148768 و R01CA142723)، ومنح دعم مركز السرطان NCI (NCI P30 CA016520)، وجائزة “كفار بنسلفانيا” (P30 منظمة العفو الدولية 045008).

Materials

Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. . Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018)
  30. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018)
  31. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018)

Tags

Merkel Cell PolyomavirusMCPyVCell Culture ModelDermal FibroblastsVirus IsolationImmunofluorescent StainingFluorescent In Situ HybridizationInfectious CycleHost Cell Interactions293TT28 CellsTransfectionST ExpressionLT Expression

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image