Colletotrichum fioriniae Sviluppo in acqua ed estratti floreali basati su cloroformio mirtillo e Cranberry

1. funghi isolati e sospensioni di Spore Isolare Colletotrichum fioriniae da un ospite infetto naturalmente19. Quindi, è possibile memorizzare le culture pulite sulla farina di mais agarici (CMA). Inserire la spina della cultura (da slant CMA) su una cella di plastica standard cultura piatto (diametro 9 cm) contenente che sia chiarito agar di succo V8 (cV8A) (modificato dal 1955 Miller), o non-chiarito V8 succo agar (V8A)20. Quando colonie iniziano a sporulare, streak conidi (masse conidial arancione) su un altro cV8A o V8A contenente piastra di coltura delle cellule (con un’ansa sterile standard) per produrre una cultura sporulanti ad alta densità.Nota: Qualsiasi procedura di protocollo con funghi dovrebbe essere eseguita in una cappa a flusso laminare per ridurre la possibilità di contaminazione colture fungine e/o le analisi biologiche. Dopo 7 giorni di crescita, con un’ansa sterile standard raccogliere una piccola quantità di conidi dalla cultura ad alta densità (toccando leggermente il ciclo alla massa conidial) e mescolare questo in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 10 mL di acqua deionizzata sterile (SDW). Vortice in questo esempio per 10 s, quindi utilizzando una pipetta standard immergersi su e giù numerose volte per ulteriori mix il campione. Quindi, mettere una goccia di campione sull’emocitometro agitati con vortex e stimare le concentrazioni di spore. Campi di conteggio 5-10 sull’emocitometro, ottenere la media e moltiplicare la media per il fattore di diluizione (cioè 10.000), ottenendo così la concentrazione conidial / mL SDW. Quindi utilizzando un volume (V) / equazione di concentrazione (C) (V1● [C1] = V2● [C2]) regolare (con SDW) a 1,0 X 105 conidi per mL di SDW con un volume finale di 5 mL. Questo è indicato come la sospensione di spore e fatta solo immediatamente prima dell’uso in entrambi analisi biologica. 2. attivo, basato su acqua floreale estratti (attivo -FE)15,16 Nota: Vedere Supplemental figura 1, supplementare nella figura 2, supplementare nella figura 3e film supplementare 1. Accuratamente a mano-raccogliere mirtillo (aprile-maggio) e mirtillo rosso (giugno-luglio) fiori durante le loro fioriture di picco rispettivi nel campo (Supplemental figura 1). Indossare e cambiare i guanti di nitrile tra punti di campionamento (cultivar-varietà/fisiche posizioni) per inibire la contaminazione dell’olio di pelle umana, nonché la contaminazione incrociata tra le varietà floreali. Fiori o mirtillo o mirtillo (da un’unica fonte) posto in sacchetti di plastica (riempite una sacca da 100 x 150 mm) e immediatamente in frigorifero a 4 ° C, una volta che i fiori sono raccolti.Nota: L’active – estrazione viene modificato da Leandro et al. (2003) 16. Prima dell’estrazione, rimuovere qualsiasi fiori deteriorati, danneggiati, malati, quindi utilizzando fiori sani rimuovere ovaie, sepali e peduncoli con pinzetta (45 ˚ pinzette) e scartare. Utilizzare solo i restanti organi (corolla, lo stigma, stile e stame) per attivo – estrazioni. Tagliare garza (150 x 150 mm) e posto all’interno di un imbuto di 7 x 7 mm, posto in una provetta da centrifuga 50ml pulito e mettere da parte. Unire 1 parte elaborata fiori a 9 parti SDW (1 wt: 9 vol ratio) in un mortaio. Macinare delicatamente con un pestello per 30 s (attenzione non completamente polverizzare i campioni). Ceppo risultante polpa attraverso preparato garza/imbuto e raccogliere in provetta da centrifuga (50 mL). Pulire o utilizzare nuovo mortaio/pestello tra ogni estrazione con 95% EtOH e acqua calda corrente. Preparare un apparato di filtrazione a vuoto: raccogliere Imbuto Buchner, matraccio di Erlenmeyer filtro del vuoto (fino a 1.000 mL di capacità), 55 mm cerchio carta da filtro e tubo/fonte di vuoto. Aggiungere carta da filtro ad un imbuto di Buchner dimensione appropriato e posto in cima al pallone, poi collegare l’apparecchiatura ad un’acqua / sorgente tramite tubo di aspirazione di aspirazione e mettere da parte. Chiarire ulteriormente gli estratti di mirtillo floreale mediante centrifugazione per 10 min a 8.055 x g. Versare sovranatante apparato preparato filtro vuoto, attivare la fonte del vuoto, filtrare il surnatante, quindi versare il contenuto del pallone in una nuova provetta da centrifuga (50 mL). Pulire tutti i componenti di apparecchi tra ogni filtrazione con 95% EtOH e acqua calda corrente. Ulteriore filtro attraverso una siringa adattato con un 0,22 µm dei pori, acetato di sterilizzazione, filtro in una nuova provetta da centrifuga (50 mL). Per gli estratti di mirtillo rosso floreali, vuoto solo filtrare attraverso carta da filtro e versare il contenuto del pallone in una nuova provetta da centrifuga (50 mL). Preparazione risultante si riferisce a come attivo- Estratto floreale (active -FE). Conservare tutti gli estratti floreali di base d’acqua (attivo- passivo-, raccolte di acqua piovana) a-20 ° C in aliquote di 5-50 mL fino uso sperimentale. Ripetere le estrazioni con campioni multipli (almeno 3 estrazioni per tipo di campione) per fornire repliche. 3. passivo , basato su acqua floreale estratti ( passare -FE) 16 Nota: Vedere film supplementare 2. Raccogliere tutta mirtillo fiori (50 g) come sopra a mano e conservare in frigorifero dopo la raccolta. Prima dell’estrazione, rimuovere qualsiasi fiori deteriorati, danneggiati, malati e rimuovere solo i peduncoli da fiore intatto. Refrigerare i campioni preparati fino a quando il passivo – sistema di estrazione, descritto di seguito, è a posto. Sciacquare tutte le parti prima dell’uso con 95% di etanolo (EtOH) e acqua calda corrente per prevenire la contaminazione (foglio di plastica della maglia, due cestelli in rete plastica, recipiente di vetro e bottiglia della foschia pompa). Anche preparare una provetta da centrifuga garza/imbuto/50 mL 4 strati per ogni estrazione come descritto sopra (al punto 2.2) e mettere da parte. Preparare il setaccio: inserire un foglio di plastica della maglia (aka chiaro bar stuoia) una maglia di plastica paniere (114 x 102 mm). Posizionare un cestello in rete secondo, identico, capovolta (invertito) in un vetro pane-pan (127 x 229 mm) (per evitare i fiori che si siede in SDW) e mettete la maglia foglio contenente cesto in cima. Aggiungere 50 g di fiori disposti nel setaccio.Nota: In alternativa, piccola provetta [pulizia] cestini possono essere usati ai panieri di maglia di plastica originalmente usato (cestelli di pinta di vecchio, verde, fragola in rete sono spesso difficili da fonte). Uniformemente nebbia fiori con 250 mL utilizzando una pompa nebbia bottiglia e catturano il deflusso nel recipiente di vetro. Poi filtrare filtrato attraverso la garza/imbuto preparato in una provetta da centrifuga pulita. Preparazione risultante è indicato come passivo- Estratto floreale (pass -FE); memorizzare come per sopra (punto 2.6). Pulire tutti i componenti tra ogni estrazione con 95% EtOH e acqua calda corrente. Ripetere estrazioni con campioni multipli per fornire replica (almeno 3 al tipo di campione). 4. cloroformio-base floreale estratti (ch-FE) 17 Raccogliere fiori di mirtillo rosso e mirtillo come per sopra (punto 2.1) e preparare i fiori per l’estrazione (punto 2.2, senza preparazione di garza/imbuto). Mantenere i fiori pronti refrigerati fino a prima dell’uso. Qualsiasi lavoro eseguito con cloroformio deve essere eseguita in una cappa aspirante per motivi di sicurezza. Questo comprende la preparazione dei materiali / cristalleria, le procedure di estrazione e analisi biologica conduttanza (passaggi utilizzando ch-FE). Pulire tutti i componenti con 95% EtOH due volte, poi due volte con cloroformio per prevenire la contaminazione per ogni estrazione: filettato provette di coltura di vetro, 2 bicchieri di vetro, in acciaio inox piccolo schermo e un cilindro di laurea [vetro]. Mettere da parte a secco a testa in giù. Sciacquare tappi di politetrafluoroetilene (PTFE) foderato due volte con 95% EtOH solo (cloroformio danneggia i materiali esterni della PAC) e mettere da parte ad per asciugare. Unire 1 parte elaborata fiori a 9 parti cloroformio (1 wt: 9 vol ratio) in un becher (fiori poi cloroformio), delicatamente ricciolo per 30 s e il ceppo attraverso uno schermo di acciaio inossidabile nel bicchiere graduato secondo. Ch-FE dal secondo bicchiere versare il tubo di vetro (10-15 mL) di cultura e apporre il tappo PTFE. Avvolgere il tappo con parafilm per evitare l’evaporazione. Questa preparazione è l’Estratto floreale basato su cloroformio (ch-FE). Conservare il campione al buio (per ridurre la degradazione luce) a 4 ° C fino all’utilizzo sperimentale. Ripetere estrazioni con campioni multipli per fornire replica (almeno 3 al tipo di campione). 5. raccolta di acqua piovana da fiori di mirtillo (BB rw-FE)16 Nota: Il dispositivo di raccolta di acqua piovana floreale di mirtillo è costituito da una tazza di spray aria pistola a spruzzo vernice monouso con adattatore di connessione (Coppa: filettatura femmina, adattatore: filettatura maschio), provette da centrifuga 50ml (polipropilene), parafilm e fili ricoperti in plastica ( filo di telefono standard, contenuto filo conduttore interno). Selezionare più posizioni all’interno di un cespuglio di mirtilli per catturare scappano di fiori prima di creare dispositivi di raccolta acqua piovana. Questi includono direttamente sotto infiorescenze (fiore) alla base del bush (corona). Record diametro degli steli (che vanno da 1-5 cm) alle posizioni selezionate, come questo determinerà la dimensione dei fori utilizzati per il fissaggio del dispositivo, descritto di seguito. Per ogni posizione selezionata creare un dispositivo di raccolta. In primo luogo un foro nella parte inferiore di una tazza di spruzzo (dove la Coppa curve verso l’apertura filettata) per il diametro corrispondente, con un po’ di passaggio collegato a una pressa di trivello. Quindi, tagliare una linea retta dalla parte superiore della giorgia_wade alla bocca della tazza dello spruzzo. 4 fori equidistanti (grande abbastanza per filo il legare rivestito di plastica), alla foce della Coppa spray e collegare un’estremità dei fili rivestiti in plastica lasciando un’estremità libera. Praticare un foro abbastanza grande da avvitare l’adattatore di Coppa spruzzatore di vernice in un coperchio di protezione 50ml centrifuga. Sigillare le filettature della scheda con parafilm per prevenire le infiltrazioni. Collegare sia il tappo di centrifuga e porzione filettata della Coppa spruzzatore. Collegare il tubo di centrifuga accoppiate 50 mL. Ripetere i passaggi da 5.3-5.4 per creare dispositivi multipli secondo percorsi selezionati, un minimo di dispositivi 4 collezione per ogni posizione di campionamento. Distribuire i dispositivi alle posizioni selezionate dalla flessione tazze spruzzatore su steli di. Orientare il taglio-lato della tazza spruzzo verso l’alto utilizzando i cavi plastica-rivestito altri steli (per assicurare acqua passando sopra i fiori viene catturato). Apporre il parafilm eventuali aperture che potrebbero verificarsi perdite di acqua piovana. (Supplemental figura 3, supplementare nella figura 4, supplementare figura 5e supplementare nella figura 6). Provette per l’etichetta, con la distribuzione di data / ora. Dopo un evento di pioggia, rimuovere e sostituire la parte inferiore (tubo) della provetta da centrifuga (etichetta data / ora di raccolta). Portare le collezioni di deflusso (denominati Estratto floreale di acqua piovana del mirtillo (BB rw-FE)) all’interno e vuoto (filtraggio descritto in passaggi 2.4-2.5). Archivio come sopra (punto 2.6), fino a quando usato in un’analisi biologica basati su acqua. 6. raccolta di acqua piovana da Cranberry fiori (CB rw-FE) Il dispositivo di raccolta di acqua piovana floreale in mirtillo rosso è costituito da un imbuto in polipropilene cm 7 X 7, provette da centrifuga 50ml (polipropilene), parafilm, e 4 standard, plastica rivestito legami di torsione (per dispositivo). In primo luogo, calore puntura 8 fori equidistanti (diametro di legami torsione) intorno alla bocca dell’imbuto utilizzando una sonda di metallo. Inserire legami torsione nei 4 fori. Attaccate gli altri capi in posizione opposta che fori, formando un reticolo ordinato incrocio. Avvolgere imbuto giù-staminali con parafilm e mettere da parte. Praticare un foro abbastanza grande per inserire l’imbuto giù-staminali in un tappo di centrifuga 50 mL con un po’ di passaggio. Inserire imbuto preparato nel tappo della centrifuga. Ripetere i passaggi 6.2-6.3 per creare più periferiche, un minimo di dispositivi 4 collezione per ogni posizione di campionamento. Distribuire i dispositivi etichettati (data/ora) in torbiere del mirtillo rosso selezionati. Ordinatamente Infilare due fiore cuscinetto infiorescenze (noti come montanti) sotto i legami incrociati plastica torsione. Quindi verticalmente orientare il dispositivo forando la provetta da centrifuga nel baldacchino del mirtillo rosso (Supplemental figure 7-8, Supplemental Movie 3). Dopo irrigazione pioggia o sovraccarico rimuovere e sostituire la parte inferiore (tubo) della provetta da centrifuga (etichetta data / ora di raccolta). Portare il deflusso (denominato Estratto floreale (CB rw-FE) di acqua piovana mirtillo rosso) all’interno e vuoto (filtraggio descritto in passaggi 2.4-2.5). Archivio come sopra (punto 2.6), fino a quando usato in un’analisi biologica basati su acqua. 7. analisi biologica utilizzando acqua base floreale estratti15,16 (attivo-FE, passare-FE, rw-FE) Nota: Vedere la Figura 1. Questa analisi biologica viene preparato in una cappa a flusso laminare. Preparare i materiali: lamelle di vetro triplo risciacquo con 95% EtOH e aria secca, quindi mettere da parte. Tagliare dischi di carta asciugamano al diametro interno di piastre di coltura una cella standard in plastica (9 cm). Posto 2 strati di dischi di carta all’interno di piastre di coltura e inzupparlo con 2 mL SDW. Preparare almeno 5 mL di un 1.0 X 105 conidi per mL di sospensione di spore SDW (c. fioriniae) come sopra (passo 1.2-1.4), mettere da parte. Successivamente, mescolare volumi uguali di SDW ed Estratto floreale di base d’acqua in 2 mL microcentrifuga. Quindi, aggiungere un volume uguale di sospensione di spore per la microcentrifuga preparato 2 mL (SDW più FE); la preparazione risultante è denominata una miscela acquosa di trattamento. Per il controllo, omettere la porzione di FE e sostituire con SDW, per mantenere le concentrazioni di conidial coerente.Nota: dimensione della porzione dipende dal numero di repliche e punti di tempo. In genere, le porzioni non superi 500 µ l. Una volta conidi e FE sono combinati ha iniziato l’analisi biologica, post-inoculazione 0 h. Posto le lamelle di vetro pre-pulito in cima le salviette di carta bagnato all’interno piastra di coltura delle cellule. Posizionare una goccia di 40 µ l di miscela acquosa trattamento al centro di un vetrino coprioggetti. Ripetere per i trattamenti desiderati, compreso il controllo, chiudere la piastra di coltura delle cellule. Ripetere in piastre di coltura cella separata per le repliche (almeno 3) e intervalli di tempo (ogni piatto è per 1 punto di tempo). Una volta che tutti i trattamenti e le repliche sono stati dispensati, inserire tutte le piastre di coltura cellulare replicati in un contenitore di plastica sigillato (30 x 13 x 7 mm) e incubare a 25° C al buio. Agli intervalli di tempo predeterminati, aggiungere 10 µ l di un fissativo come lattofenolo cotone-blu (20,0 g di cristalli di fenolo, 20,0 mL 2,5% acido lattico, glicerolo 40,0 mL, blu di cotone 0,05 g) per le goccioline, fermando la crescita e semi-preservare il Monte. Aspettare 2 ore per raccogliere il punto di tempo 0 h come questo permette conidial adesione alla superficie del vetro, ma non è abbastanza lungo per la germinazione conidial. Per tutti gli altri punti di tempo, è possibile aggiungere fissativo in fase corrispondente. Una volta che è stato aggiunto un fissativo, attentamente invertire i coprioggetti, mettendoli sul lato goccia giù su un vetrino per microscopio per facilitare l’esame al microscopio (1 vetrino coprioggetto per vetrino). Quando tutte le lamelle sono sui vetrini, lasciare loro di stabilirsi e parzialmente asciugare nella cappa flusso per 20 min. Conteggio di tutti i conidi (Totale conidi) presentano sul vetrino coprioggetti (primari conidi, germinati conidi e neonate conidi secondari) come pure di appressoria a entrambi 400 X ingrandimento (contando 16 campi) o 200 X (contando 4 campi), per un totale di un’area di 3,808 mm 2. replicare intera analisi biologica per l’analisi statistica. Per i dosaggi usare Idropittura FE, analizzare dati come descritto nella Waller et al. 201716, in genere visualizzati come media count/mm2 (Totale conidi o appressoria). 8. analisi biologica utilizzando basati su cloroformio floreali estratti (ch-FE)17 Nota: Vedere la Figura 2. Preparare i materiali e delle cellule di piastre di coltura come per sopra (passi 7,1). Inoltre, sciacquare un numero uguale di Van Tieghem (VanT. cellule) (8mm OD, ID 6 mm) per vetrini coprioggetti, come pure una pipetta di vetro (1 mL con incrementi di 1 µ l) all’interno di una cappa aspirante, (due volte con il 95% EtOH poi due volte con il cloroformio) e mettere da parte. In cappa a flusso laminare, utilizzando un tubo del microcentrifuge 2 mL aggiungere due volumi uguali (almeno 500 porzioni µ l) di SDW e 1 volume di sospensione di spore, quindi mettere da parte. Questa è la miscela acquosa trattamento per analisi biologiche ch-FE. In una cappa aspirante, posto un VanT. delle cellule sul vetrino coprioggetti all’interno piastra di coltura preparati cella in plastica. Dispensare (con una pipetta di vetro) 33 µ l di desiderato ch-FE in al centro della cellula T. Van (non toccare le pareti del VanT. Cella; per il trattamento di controllo, aggiungere Vergine cloroformio) e lasciare per asciugare. Ripetere in piastre di coltura cella separata per le repliche (almeno 3). Una volta ch-FE ha asciugato, dispensare 99 µ l della miscela preparata trattamento acquosa con una pipetta standard nel centro della VanT. cella, poi Chiudi tutto cellula piastre di coltura. Una volta che la miscela acquosa trattamento ha venuto a contatto con i trattamenti secchi ch-FE, ha iniziato l’analisi biologica, post-inoculazione 0 h. Una volta che tutti i trattamenti e le repliche sono stati dispensati, inserire tutte le piastre di coltura di cellule (chiuse) in un contenitore di plastica sigillato (30 x 13 x 7 mm) e incubare a 25° C al buio. Agli intervalli di tempo predeterminati, aggiungere 15 µ l di un fissativo (lattofenolo cotone-blu) per il VanT. cellulare e lasciare riposare per almeno 5 min assicurare adeguata colorazione fungine. Dopo quel tempo, rimuovere con cautela il VanT. Cellulari e seguire coprioggetto inversione e dati acquisizione passaggi sopra (passi 7,5-7,6). Per l’analisi dei dati, seguire i metodi descritti nel 2015 Gager17, in genere, come formazione di appressorium, visualizzazione dei dati, che è il rapporto tra totale conidi di appressoria contato nella zona osservata (3,808 mm2). 9. mirtillo basati su fenologia estrazioni17 Mano raccogliere fiori del mirtillo rosso (nel mese di giugno; 100 g), immaturi di frutta (due volte; Luglio e agosto; 200 g) e maturare frutta mirtillo al momento del raccolto (ottobre; 200 g), posto in sacchetti di plastica dimensioni appropriate e conservare in frigorifero a 4 ° C immediatamente dopo la raccolta. Utilizzare le precauzioni di contaminazione descritte sopra (punto 2.1).Nota: Ci sarà materiale supplementare pianta raccolti in ogni momento, ma questi importi guardia contro l’estrazione ovviamente fungine ovaie infette e frutta (da sintomi e segni di malattia). Prima dell’estrazione, rimuovere qualsiasi fiori deteriorati, danneggiati, malati, quindi utilizzando solo sani fiori, rimuovere i sepali, peduncoli, corolle, stigmi, stili e stami con pinzetta (pinzetta 45 °) ed eliminare tutti, ma le ovaie. Una volta che le ovaie sono raccolti, eseguire l’estrazione basata su cloroformio a 1 wt: 9 rapporto di vol (dettagliato in passi 4.2-4.4, usando solo le ovaie). Conservare i campioni fino a quando tutte le altre estrazioni sono complete, cioè fino a conduttanza di analisi biologica. Una volta frutta vengono raccolti, esegue un’estrazione basata su cloroformio (passaggi 4.2-4.4, utilizzando frutta raccolti invece di fiori), ma aggiunga 10 g di frutta a 90 mL di cloroformio e una volta estratte, lasciare che la soluzione di evaporare a 9 mL (con conseguente un wt 9 mL 10 g: : soluzione vol). Effettuare estrazioni di frutta immediatamente dopo la raccolta in luglio, agosto e ottobre. Memorizzare come per sopra (punto 4.4) fino a quando tutte le estrazioni vengono raccolti. Dopo l’ultima estrazione di cloroformio-base frutta, sottoporre tutti gli estratti di cloroformio basati su Penalogia raccolti per questa analisi all’analisi biologica basati su cloroformio e analizzare conseguenza (punti 8.1-8.6).