Colletotrichum fioriniae Su ve kloroform tabanlı yaban mersini ve kızılcık çiçek özleri kalkınma

1. mantar yalıtır ve spor süspansiyonlar Colletotrichum fioriniae doğal enfekte konak19yalıtmak. O zaman, temiz kültürler Mısır yemek agar (CMA) yatık depolar. Fiş üzerine standart plastik hücre kültür çanak (9 cm Çap) ya V8 suyu agar (cV8A) (Miller 1955 değiştirilmiş) veya sigara açıklık V8 suyu agar (V8A)20açıklık içeren bir kültür (dan CMA eğik) yerleştirin. Koloniler sporulate başlar, conidia (turuncu conidial kütlesi) başka bir cV8A veya V8A çizgi bir yüksek yoğunluklu sporulating kültür üretmek için hücre kültür çanak (ile standart bir kısır döngü) içeren.Not: Mantarlar ile herhangi bir iletişim kuralı merdiven mantar kültürleri ve/veya BİYOANALİZLER kirletici olasılığını azaltmak için Laminar akış mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor. Sonra büyüme, standart bir kısır döngü kullanarak 7 gün (hafifçe döngü conidial kitle için dokunarak) yüksek yoğunluklu kültüründen conidia az miktarda toplamak ve bu 10 mL steril deiyonize su (SDW) içeren bir 15 mL santrifüj tüpüne karıştırın. Girdap 10 için bu örnek s, daha sonra standart bir pipet kullanarak Dalma yukarı ve aşağı birçok kere daha da karıştırmak için örnek. Sonra bir damla vortexed örnek hemasitometre üzerine yerleştirin ve spor konsantrasyonları tahmin ediyoruz. Hemasitometre sayısı 5-10 alanların ortalama almak ve ortalama uygun seyreltme faktörü tarafından (Yani 10.000), çarpma böylece mL SDW başına conidial konsantrasyonu elde etmek. Bir birim (V) için / konsantrasyon (C) denklemi (V1● [C1] V2● [C2] =) (SDW) 1.0 X 105 conidia SDW mL 5 mL son hacim ile başı için ayarlayın. Bu, spor süspansiyon adlandırılır ve yalnızca her iki bioassay kullanmak için hemen önce yapılır. 2. aktif, su bazlı çiçek özleri (etkin -FE)15,16 Not: Bkz: tamamlayıcı şekil 1, tamamlayıcı Şekil 2, tamamlayıcı şekil 3ve tamamlayıcı film 1. Dikkatle el-blueberry (Nisan-Mayıs) ve kızılcık (Haziran-Temmuz) çiçekler (tamamlayıcı şekil 1) alanında onların anılan sıraya göre en yüksek blooms sırasında ödemeli. Giyim ve nitril eldiven yanı sıra insan derisi yağ kirlenme inhibe kirlenme çiçek çeşitleri arasında çapraz için örnekleme konum (çeşitlerin/çeşitleri/fiziksel konumlar) arasında değiştirmek. Yaban mersini veya kızılcık çiçek (tek bir kaynaktan) (100 x 150 mm çantayı Doldur) plastik torbalar yerleştirin ve çiçekleri toplanan bir kez 4 ° C’de hemen buzdolabına.Not: Etkin – ekstraksiyon Leandro ve arkdeğiştirilir. (2003) 16. Önce çıkarımı, bozulan, hasarlı, hastalıklı çiçek kaldırın ve sonra sağlıklı çiçek kullanarak eğri forseps (45˚ cımbız) ile yumurtalık, sepals ve peduncles kaldırmak ve atmak. Sadece kalan organları (corolla, stigma, stil ve ercik) aktif – çekimi için kullanın. Tülbent (150 x 150 mm) kesip bir 7 x 7 mm huni içinde yer, bir temiz 50 mL santrifüj tüpüne yerleştirin ve bir kenara koyun. 1 birleştirmek bölümü işlenen 9 parça SDW çiçek (1 wt: 9 vol oranı) bir harç içinde. Yavaşça 30 bir havaneli ile eziyet s (tamamen örnekleri ezmek için göz kulak). Elde edilen hamuru hazır tülbent/huni strain ve santrifüj tüpü (50 mL) toplamak. Temiz ya da yeni harç/havaneli alkol ile her çıkarma ve sıcak su arasında kullanın. Bir vakum filtrasyonu cihaz hazırlamak: Buchner huni, vakum filtre Erlenmeyer şişesi (en çok 1000 mL kapasiteli), 55 mm daire filtre kağıdı ve vakum hortumu/kaynak toplamak. Filtre kağıdı için uygun ölçekli Buchner huni ekleyin ve balonun yerleştirin sonra bir su cihazları bağlamak / kaynak yolu ile vakum hortumu emme ve bir kenara koyun. Daha fazla yaban mersini çiçek özleri 8,055 x g, 10 dk centrifuging tarafından açıklığa kavuşturmak. Süpernatant hazırlanan vakum filtre aparatı dökün, vakum kaynağında açmak, süpernatant filtre sonra şişeye içeriği yeni santrifüj tüpüne (50 mL) dökün. Tüm cihazlar bileşenler arasında her filtrasyon alkol ve sıcak su temiz. Bir şırınga aracılığıyla daha fazla filtre uygulamak 0,22 µm gözenek boyutu, sterilizasyon, asetat filtre yeni santrifüj tüpü (50 mL) içine uyarlanmış. Kızılcık çiçek özleri için yalnızca filtre filtre kağıdı ile vakum ve şişesi içeriği yeni santrifüj tüpüne (50 mL) dökün. Elde edilen hazırlık için etkinolarak – çiçek özü (etkin -FE) denir. Tüm su bazlı çiçek özleri (aktif- pasif-, yağmur suyu koleksiyonları) 5-50 mL aliquots-20 ° c kadar deneysel kullanım saklayın. Birden çok örnekleri (örnek türü başına en az 3 çekimi) ile çekimi çoğaltır sağlamak için yineleyin. 3. pasif , su bazlı çiçek özleri ( geçmek -FE) 16 Not: Ek 2filme. Toplamak tüm yaban mersini çiçekler (50 g) Yukarıdaki gibi el ve topladıktan sonra buzdolabında bekletin. Önce çıkarımı, bozulan, hasarlı, hastalıklı çiçek sadece peduncles sağlam çiçek sökün ve. Aşağıda açıklanan pasif – emme sistemi, yer kadar hazır örnekleri buzdolabında bekletin. % 95 etanol (alkol) ve sıcak su ile (plastik kafes sayfası, iki plastik hasır sepet, cam ekmek pan ve pompa sis şişe) önlemek amacıyla kullanmadan tüm bileşenleri önce yıkayın. Ayrıca her ayıklama açıklandığı gibi yukarıda (Adım 2.2) ve kenara için 4 katman tülbent/huni/50 mL santrifüj tüpü hazırlayın. Elek hazırlamak: bir plastik kafes levha (aka Örtüleme bar açık) bir plastik hasır sepet (114 x 102 mm) içine yerleştirin. Baş aşağı bir ikinci, benzer, hasır sepet koyun (bir cam ekmek-(SDW içinde oturan çiçekler) önlemek için pan (127 x 229 mm) ve yer ters) mesh sac üstüne içeren sepet. Hazır çiçekler 50 g elek ekleyin.Not: Alternatif olarak, küçük tüp [temizlik] sepetleri (eski, yeşil, çilek kafes pint sepetler genellikle kaynak zordur) başlangıçta kullanılan plastik hasır sepetleri yerine kullanılabilir. Eşit olarak sis çiçeklerle bir pompa kullanarak 250 mL şişe mist ve akış cam ekmek tavada yakalamak. O zaman filtrate hazır tülbent/huni temiz santrifüj tüpüne süzün. Elde edilen hazırlık için pasif- çiçek özü (pass -FE); denir olarak başına (yukarıdaki adım 2.6) depolar. Tüm bileşenler arasında her çıkarma alkol ve sıcak su temiz. Sağlamak için birden çok örnekleri ile tekrar çekimi (örnek türü başına en az 3) çoğaltır. 4. kloroform tabanlı çiçek özleri (ch-FE) 17 (Adım 2.1) yukarıda olarak başına yaban mersini ve kızılcık çiçekleri toplamak ve çiçekler çıkarılması (Adım 2.2, tülbent/huni hazırlık yapmadan) için hazır olun. Hazır çiçekler kullanımı kadar önce buzdolabında tutun. Güvenlik nedeniyle bir duman başlıklı kloroform ile gerçekleşen herhangi bir çalışma yapılması gerekiyor. Bu malzemelerin hazırlanması içerir / Züccaciye Mağazaları, çıkarma işlemleri ve bioassay gürültülerinden (ch-FE kullanarak adımları). % 95 ile tüm bileşenleri temiz alkol iki kez, o zaman iki kez her çıkarılması için kontaminasyonu önlemek için kloroform ile: dişli cam kültür tüpleri, 2 cam şişeler, küçük paslanmaz çelik ekran ve [cam] lisansüstü silindir. Kuru baş aşağı için kenara koyun. 95 ile iki kez politetrafloroetilin (PTFE) kaplı kapaklar durulama % alkol sadece (kloroform kap dış malzemelerin hasar) ve kuruması için bir kenara koyun. 1 birleştirmek bölümü işlenen 9 parça kloroform çiçek (1 wt: 9 vol oranı) bir ölçek (sonra kloroform, yavaşça çiçekler) girdap 30 s ve zorlanma ikinci kabı içine bir paslanmaz çelik ekran aracılığıyla. CH-ikinci kabı FE’den cam kültür tüp (10-15 mL) içine dökün ve PTFE kap yapıştırmayın. Buharlaşma önlemek için parafilm kapaklı sarın. Bu hazırlık kloroform tabanlı çiçek özü (ch-FE) benzer. Örnek (hafif bozulma azaltmak için) 4 ° C’de karanlık kadar deneysel kullanım saklayın. Sağlamak için birden çok örnekleri ile tekrar çekimi (örnek türü başına en az 3) çoğaltır. 5. yağmur suyu Blueberry çiçekler (BB rw-FE)16 topluluğu Not: Yaban mersini çiçek yağmur suyu toplama aygıt bir hava tabancası tek kullanımlık boya sprey Kupası konnektör adaptör’ü ile oluşur (Kupası: kadın iş parçacığı, adaptörü: erkek-erkek iplik), 50 mL santrifüj tüpleri (polipropilen), parafilm ve plastik kaplı teller () Standart telefon kablosu, bireysel iç tel strand içeriği). Yağmur suyu toplama aygıtları oluşturmadan önce çiçek kapalı çalıştırmak yakalamak için bir yaban mersini çalı içinde çoklu konumlarını seçin. Bunlar doğrudan altında çiçek (çiçek) için üsten Bush (taç) içerir. (1-5 cm arasında değişen) kaynaklanıyor bu seçili yerlerde kayıt çapı aygıt eki, aşağıda açıklanan için kullanılan delik boyutunu belirleyecektir. Seçilen her konum için bir koleksiyon aygıt oluşturabilirsiniz. İlk adım biraz bir matkap basın bağlı (doğru dişli açılış Kupası nerede eğrileri) bir sprey kupasına karşılık gelen kök çapı dibinde bir delik delme. Sonra çukuru üstünden düz bir çizgi ağız spreyi Kupası için kesti. 4 eşit uzaklıkta (plastik kaplı tel iş parçacığına büyüklükte), sprey Kupası ağzında delik ve bir ucu serbest bırakarak plastik kaplı tellerin bir ucunu takın. Boya püskürtme Kupası bağdaştırıcısı 50 mL santrifüj kap kapağı iplik kadar büyük delik. Bağdaştırıcı konu sızıntı önlemek için parafilm ile kapatın. Bu santrifüj kap ve püskürtücü Kupası dişli bölümü ekleyin. Şeklindeki 50 mL santrifüj tüpü takmak. Seçilen konumları, örnekleme konum başına 4 koleksiyonu cihazların en az göre birden çok aygıt oluşturmak için 5,3 5,4 adımları yineleyin. Seçilen konumları cihazlar kaynaklanıyor uyacak püskürtücü bardak esneme tarafından dağıtın. Sprey fincan yukarı doğru (çiçek geçen su yakalanır sigorta ettirmeleri) diğer kaynaklanıyor bağlı plastik kaplı teller kullanarak kesme tarafına gelecek şekilde yönlendirin. Parafilm yağmur suyu sızdırabilirsiniz herhangi bir açıklıklar yapıştırmayın. (Tamamlayıcı şekil 3, tamamlayıcı şekil 4, tamamlayıcı Şekil 5ve ek şekil 6). Etiket koleksiyonu tüpler dağıtımı ile tarih / saat. Bir yağmur olaydan sonra kaldırmak ve santrifüj tüpü alt (tüp) bölümünü değiştirin (etiket tarih / zaman koleksiyonu). İçinde (yaban mersini yağmur suyu çiçek özü (BB rw-FE) anılacaktır) ikinci tur koleksiyonlarını getirin ve filtre (filtrasyon açıklanan adımları 2.4-2.5) vakum. Deposu olarak (Adım 2.6), yukarıda bir su bazlı bioassay kullanana kadar. 6. yağmur suyu kızılcık çiçekler (CB rw-FE) üzerinden topluluğu Kızılcık çiçek yağmur suyu toplama cihazda bir 7 X 7 cm polipropilen huni, 50 mL santrifüj tüpleri (polipropilen), parafilm, oluşur ve büküm bağları (aygıt başına) 4 standart, plastik kaplı. İlk olarak, ısı 8 eşit uzaklıkta delik (twist kravat çapını) bir metal sonda kullanarak huni ağız çevresindeki delik. Twist Kravat 4 deliklere yerleştirin. Diğer uçları düzgün geçiş desen oluşturan bu delik ters konumuna, iliştirin. Huni aşağı-kök parafilm ile sarın ve bir kenara koyun. Adım biraz 50 mL santrifüj kap içine huni aşağı kök eklemek için büyük delik. Hazırlanan huni santrifüj kap yerleştirin. Birden çok aygıt, örnekleme konum başına 4 koleksiyonu cihazların en az oluşturmak için 6.2-6,3 adımları yineleyin. Etiketli (Tarih/Saat) aygıtları seçili kızılcık bataklıkları dağıtın. Düzgünce (diki da bilinir) iki çiçek taşıyan çiçeklenme çapraz plastik twist kravat altında tuck. Sonra dikey olarak cihaz santrifüj tüpü kızılcık tepeye (tamamlayıcı rakamlar 7-8, tamamlayıcı film 3) delici tarafından yönlendirmek. Yağış veya ek yük sulama sonra kaldırmak ve santrifüj tüpü alt (tüp) bölümünü değiştirin (etiket tarih / zaman koleksiyonu). İçinde (kızılcık yağmur suyu çiçek özü (CB rw-FE) anılacaktır) akış getirmek ve filtre (filtrasyon açıklanan adımları 2.4-2.5) vakum. Deposu olarak (Adım 2.6), yukarıda bir su bazlı bioassay kullanana kadar. 7. bioassay15,16 su dayalı çiçek özleri kullanarak (etkin-FE, pass-FE, rw-FE) Not: Bkz. şekil 1. Bu bioassay bir Laminar akış mahallede hazırlanır. Malzemeleri hazırlamak: alkol ve hava kuru, çift durulama cam coverslips bir kenara koymak. Kağıt havlu diskleri standart plastik hücre kültür yemekleri (9 cm) iç çapını kesti. 2 kat kağıt disklerin kültür yemekleri içinde yerleştirin ve 2 mL SDW ile ıslatın. En az 5 mL 1.0 X 10 mL SDW spor süspansiyon (C. fioriniae) olarak başına (Adım 1.2-1.4), yukarıda başına5 conidia bir kenara koyun hazırlamak. Daha sonra microcentrifuge tüpler SDW ve 2 mL su bazlı çiçek özü eşit miktarda karıştırın. Sonra spor süspansiyon, eşit bir birim hazır 2 mL microcentrifuge tüpler (SDW artı FE); ekleme elde edilen hazırlık bir sulu tedavi karışımı adlandırılır. Denetimin, FE bölümü atlayın ve conidial konsantrasyonları tutarlı tutmak için SDW ile değiştirin.Not: porsiyon büyüklüğü çoğaltır ve zaman-puan sayısına bağlıdır. Tipik olarak, bazı bölümleri 500 µL fazla olamaz. Bir kez conidia ve FE kombine bioassay başladı, 0 h sonrası aşılama. Önceden temizlenmiş cam coverslips batırılmış kağıt havlu üzerine hücre kültür tabak içinde yerleştirin. 40 µL damlacık sulu tedavi karışımı bir coverslip merkezine yerleştirin. Hücre kültür çanak yakın, denetimi de dahil olmak üzere istenilen tedavi için yineleyin. Ayrı hücre kültür yemekleri çoğaltmalar (en az 3) ve zaman puan (her yemeğin 1 saat için noktasıdır) için yineleyin. Bir kez tüm tedaviler ve çoğaltır reçete, tüm çoğaltılmış hücre kültür yemekler mühürlü plastik kap (30 x 13 x 7 mm) yerleştirin ve 25 ° c karanlıkta kuluçkaya. Önceden belirlenen zaman-noktalarda, lactophenol pamuk-mavi (20.0 g fenol kristalleri, 20.0 mL % 2.5 laktik asit, 40.0 mL gliserol, 0,05 g pamuk mavi) gibi bir sabitleştirici 10 µL büyüme durdurma damlacıkları için eklemek ve yarı konserve mount. 2 h 0 h saat noktası olarak bu cam yüzeye conidial yapışma sağlar ancak conidial çimlenme için uzun değildir toplamak için bekleyin. Diğer tüm zaman puan için karşılık gelen sabitleştirici ekleyebilirsiniz. Bir sabitleştirici eklendikten sonra dikkatle onları damlacık yan aşağı mikroskobik inceleme (slayt başına 1 coverslip) kolaylaştırmak için cam mikroskop slayda yerleştirerek coverslips, tersine çevirin. Tüm coverslips cam mikroskop slaytlar üzerinde olduğunda, altlık yerleşmek ve kısmen kuru akışı başlıklı 20 dk için. Tüm conidia (Toplam conidia) yanı sıra appressoria de 400 X büyütme (16 alanları hariç) veya 200 X (4 alanları hariç), coverslip (birincil conidia, germinated conidia ve yeni kurulan ikincil conidia) mevcut sayısı 3.808 mm bir alan toplam alma 2. çoğaltmak istatistiksel analiz için tüm bioassay. Su bazlı FE kullanarak deneyleri için Waller ve ark. içinde açıklandığı gibi veri analiz genellikle görüntülenen olarak ortalama sayısı/mm2 (Toplam conidia veya appressoria) 201716. 8. bioassay17 çiçek özleri (ch-FE) kloroform tabanlı kullanma Not: Şekil 2bakın. Malzemeleri hazırlamak ve kültür yemekleri olarak başı yukarıda (merdiven 7.1) hücre. Ayrıca, coverslips, bir duman başlık içinde cam pipet (1 mL 1 µl artışlarla) olarak (8 mm OD, 6 mm ID) Van Tieghem hücreler (VanT. hücreleri) eşit sayıda durulama (iki kez ile % 95 alkol sonra kloroform ile iki kez) ve bir kenara koyun. Laminar akış Hood, 2 mL microcentrifuge tüp kullanarak iki eşit birim SDW (en az 500 µL bölümleri) ve 1 spor süspansiyon hacmi ekleyin, sonra bir kenara koyun. Ch-FE BİYOANALİZLER sulu tedavi karışımı bu. Bir duman başlık, bir VanT yerleştirin. hazır plastik hücre kültür çanak içinde bir cam coverslip hücreye. (Cam pipet ile) istenen ch-Fe 33 µL Van T. hücrenin merkezine dağıtmak (VanT duvarlara dokunma. Hücre; Denetim tedavisi için bakire kloroform Ekle) ve kurumasını bekleyin. Ayrı hücre kültür yemekleri çoğaltmalar (en az 3) için yineleyin. Bir kez standart bir pipet ile hazırlanan sulu tedavi karışımı 99 µL VanT merkezine dağıtmak kurutulmuş, CH-FE vardır. hücre, sonra yakın tüm kültür yemekleri hücre. Bir kez sulu tedavi karışımı kurutulmuş ch-FE tedaviler ile temas geldi, bioassay başladı, 0 h sonrası aşılama. Bir kez tüm tedaviler ve çoğaltır reçete, tüm (kapalı) hücre kültür yemekler mühürlü plastik kap (30 x 13 x 7 mm) yerleştirin ve 25 ° c karanlıkta kuluçkaya. Önceden belirlenen zaman-noktalarda, bir sabitleştirici (lactophenol pamuk-mavi) 15 µL VanT için ekleyin. hücre ve yeterli mantar boyama sigortalamak en az 5 min için oturmak izin. Bu saatten sonra VanT dikkatli bir şekilde çıkarın. hücre ve (adım 7.5-7,6) Yukarıdaki coverslip inversiyon ve veri alma adımları izleyin. Veri analizi için Gager 201517(3.808 mm2) gözlenen alanında sayılan appressoria için toplam conidia oranı olan appressorium oluşumuolarak, genellikle veri görüntüleme, açıklanan yöntemleri uygulayın. 9. kızılcık fenoloji tabanlı çekimi17 El kızılcık çiçek toplamak (Haziran; 100 g), olgunlaşmamış meyve (iki kez; Temmuz ve Ağustos; 200 g) ve olgun kızılcık meyve hasat (Ekim; 200 g), uygun ölçekli plastik torbalar içine yerleştirin ve 4 ° C’de hemen toplandıktan sonra buzdolabında bekletin. (Yukarıdaki adım 2.1) özetlenen kirlenme önlemleri kullanın.Not: Her zaman toplanan ilave bitki materyali olacak ama bu tutarları belli ki mantar virüslü yumurtalıklar ve (belirtiler ve hastalığın belirtileri gösteren) meyve ayıklama karşı korumak. Önce çıkarımı, bozulan, hasarlı, hastalıklı çiçek kaldırın ve sonra sadece sağlıklı çiçek kullanarak, sepals, peduncles, corollas, Tepecik, stilleri ve stamens eğri forseps (45 ° cımbız) ile kaldırmak ve tüm yumurtalık atın. Sonra yumurtalık toplanır, bir 1 kloroform tabanlı ayıklama gerçekleştirmek wt: 9 vol oranı (yalnızca yumurtalık kullanarak adımları 4.2-4.4, ayrıntılı). Saklamak örnekleri diğer çekimi tamamlanana kadar Yani bioassay gürültülerinden kadar. Meyve toplanan, kloroform tabanlı ayıklama (Adım 4.2-4.4,), toplanan meyve çiçek yerine kullanarak yapmak ama kloroform için 90 mL 10 g meyve ekleyin ve kez kez çözüm 9 ml (10 g 9 mL wt sonuçlanan buharlaşır için bekleyin : vol çözüm). Meyve çekimi hemen Temmuz, Ağustos ve Ekim aylarında topladıktan sonra olun. Olarak başına kadar tüm çekimi toplanır (yukarıdaki adım 4.4) depolar. Son kloroform tabanlı meyve ayıklama sonra bu tahlil için kloroform tabanlı bioassay için toplanan tüm penoloji tabanlı kloroform özleri konu ve buna göre analiz (8.1-8,6 adımlar).