Colletotrichum fioriniae Desenvolvimento em água e extratos florais baseado em clorofórmio Blueberry e Cranberry

1. fungos isolados e suspensões de esporos Isole o Colletotrichum fioriniae de um hospedeiro naturalmente infectado19. Em seguida, armazene as culturas limpas em inclinações de ágar (CMA) de farinha de milho. Coloque o plugue de cultura (de cunho CMA) para uma cultura celular de plástico padrão prato (9 cm de diâmetro) contendo que também esclareceu ágar de suco V8 (cV8A) (modificado de Miller 1955), ou não-esclarecido V8 suco agar (V8A)20. Quando as colónias começam a esporular, raia conídios (laranja massas conidiais) em outro cV8A ou V8A contendo prato de cultura celular (com um loop padrão estéril) para produzir uma cultura sporulating high-density.Nota: Quaisquer etapas de protocolo com fungos devem ser realizadas em uma capa de fluxo Laminar para reduzir a possibilidade de contaminação de culturas fúngicas e/ou bioensaios. Após 7 dias de crescimento, usando um loop padrão estéril coletar uma pequena quantidade de conídios de cultura de alta densidade (tocando levemente o loop para a massa conidiais) e agitar isto em um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 10 mL de água destilada estéril (SDW). Vórtice esta amostra para 10 s e, em seguida, usando uma pipeta padrão mergulhar subir e descer inúmeras vezes a mistura mais a amostra. Em seguida, coloque uma gota da amostra para o hemocytometer vortexed e estimar as concentrações de esporos. Campos do Conde 5-10 sobre a hemocytometer, obter a média e multiplicar a média pelo fator de diluição adequada (ou seja, 10.000), obtendo-se assim a concentração conidiais por mL SDW. Em seguida, usando um volume (V) / equação de concentração (C) (V1● [C1] = V2● [C.2]) ajustar (com SDW) a 1,0 X 105 conídios / mL de SDW com um volume final de 5 mL. Isto é referido como a suspensão de esporos e é feito apenas imediatamente antes da utilização em qualquer bioensaio. 2. ativo, extratos florais à base de água (ativo -FE)15,16 Nota: Ver Figura suplementar 1, suplementar Figura 2, suplementar Figura 3e filme suplementar 1. Mirtilo cuidadosamente mão-coletar (abril-maio) e amora (Junho-Julho) flores, durante suas respectivas pico flores no campo (Supplemental Figura 1). Vestir e mudar de luvas de nitrilo entre locais de amostragem (locais de cultivares/variedades/físico) para inibir a contaminação do óleo de pele humana, bem como a contaminação cruzada entre variedades florais. Coloque as flores de mirtilo ou arando (a partir de uma única fonte) em sacos de plástico (encher um saco de 100 x 150 mm) e imediatamente refrigerar a 4 ° C, uma vez que as flores são coletadas.Nota: A extração do ativo – é modificada de Leandro et al. (2003) 16. Antes da extracção, remover qualquer flores deterioradas, danificados, doentes, em seguida, usando flores saudáveis remover os ovários, sépalas e pedúnculos com pinça curvada (pinça de 45º) e descarte. Use apenas os restantes órgãos (corolla, estigma, estilo e estame) para ativo – extrações. Corte a gaze (150 x 150 mm) e coloque dentro de um funil de 7 x 7 mm, coloque em um tubo de centrífuga de 50ml limpo e reserve. Combine 1 parte processada flores para 9 partes SDW (1 wt: 9 relação de vol) em um almofariz. Lixar suavemente com um pilão para 30 s (tome cuidado para não completamente pulverizar as amostras). Coe a polpa resultante através da gaze/funil preparado e coletar em tubo de centrífuga (50 mL). Limpar ou usar argamassa/pilão novo entre cada extracção com 95% EtOH e água corrente morna. Preparar um aparelho de vácuo filtração: reunir funil Buchner, frasco de Erlenmeyer de filtro de vácuo (até 1.000 mL de capacidade), papel de filtro 55mm círculo e mangueira de vácuo/fonte. Adicionar o papel de filtro para um funil de Buchner de tamanho adequado e coloque no topo do balão, em seguida, conectar o aparelho a uma água / fonte via vácuo mangueira de sucção e reserve. Esclarecer os extratos florais de mirtilo por centrifugação por 10min a 8.055 x g. Decantar o sobrenadante no aparelho preparado filtro de vácuo, ligue a fonte de vácuo, filtrar o sobrenadante e, em seguida, despeje o conteúdo do frasco para um novo tubo de centrifugação (50 mL). Limpe todos os componentes do aparelho entre cada filtração com 95% EtOH e água corrente morna. Filtro adicional através de uma seringa adaptada com um 0,22 µm tamanho do pore, acetato de esterilização, filtro para um novo tubo de centrifugação (50 mL). Para os extratos florais arandos, só vácuo filtrar através de filtro de papel e despeje o conteúdo do frasco para um novo tubo de centrifugação (50 mL). Preparação resultante é referida como ativo- extrato floral (ativo -FE). Armazene todos os extractos florais à base de água (ativo- passivo-, coleções de água da chuva) a-20 ° C em alíquotas de 5-50 mL até o uso experimental. Repita as extrações com várias amostras (pelo menos 3 extrações por tipo de amostra) para fornecer Replica. 3. passivo , extratos florais à base de água ( passe -FE) 16 Nota: Ver filme suplementar 2. Dê flores de mirtilo todo cobrar (50 g) como acima e leve à geladeira após a coleta. Antes da extracção, remover qualquer flores deterioradas, danificados, doentes e remover apenas os pedúnculos de flor intacta. Refrigere amostras preparadas até o passivo – sistema de extração, descrito abaixo, está no lugar. Enxague todas antes de componentes para usar com 95% de etanol (EtOH) e água corrente quente para evitar a contaminação (folha do engranzamento plástico, duas cestas de engranzamento plástico, vidro Cuba e garrafa de névoa de bomba). Também prepare um tubo de centrifugação de gaze/funil/50 mL de 4 camadas para cada extração como descrito acima (passo 2.2) e reserve. Preparar a peneira: Coloque uma folha de plástico malha (aka clara bar esteiras) em uma cesta de uma malha de plástico (114 x 102 mm). Coloque um cesto de malha segundo, idênticos, de cabeça para baixo (invertido) em um vidro pão-pan (127 x 229 mm) (para evitar flores sentado em SDW) e coloc a malha folha contendo cesta no topo. Adicione 50 g de flores preparadas para a peneira.Nota: Como alternativa, cestas de pequeno tubo de ensaio [limpeza] podem ser usadas no lugar das cestas de engranzamento plástico originalmente usado (malha Velha, verde, morango pinta cestas são frequentemente difíceis de fonte). Uniformemente névoa flores com 250 mL, usando uma bomba de garrafa da névoa e capturar o segundo turno em vidro pão-pan. Depois coe filtrado através do gaze/funil preparado em um tubo de centrifugação limpo. Preparação resultante é conhecida como passivo- extrato floral (pass -FE); loja conforme acima (passo 2.6). Limpe todos os componentes entre cada extracção com 95% EtOH e água corrente morna. Extrações de repetição com várias amostras para fornecer Replica (pelo menos 3 por tipo de amostra). 4. baseado em clorofórmio extratos florais (ch-FE) 17 Recolher flores de mirtilo e cranberry como por acima (passo 2.1) e preparar as flores para extração (passo 2.2, sem preparação de gaze/funil). Manter flores preparadas refrigeradas até antes da utilização. Qualquer trabalho realizado com clorofórmio deve ser executado em uma coifa por razões de segurança. Isso inclui a preparação de materiais / produtos vidreiros, procedimentos de extração e condutância bioensaio (etapas usando ch-FE). Limpar todas as peças com 95% EtOH duas vezes, em seguida, duas vezes com clorofórmio para evitar a contaminação por cada extracção: rosca tubos de cultura de vidro, 2 copos de vidro, tela pequena de aço inoxidável e um cilindro graduado [vidro]. Reserve a seco de ponta-cabeça. Lave as tampas de politetrafluoretileno (PTFE) alinhada duas vezes com 95% EtOH apenas (clorofórmio irá danificar os materiais exteriores da PAC) e reserve para secar. Combinar 1 parte processada flores para 9 partes de clorofórmio (1 wt: rácio de vol 9) num copo (flores então clorofórmio), suavemente redemoinho por 30 s e a tensão através de uma tela de aço inoxidável para o segundo copo. Despeje o tubo de cultura de vidro (10-15 mL) ch-FE do segundo copo e fixe a tampa PTFE. Enrole a tampa com o parafilm para evitar a evaporação. Esta preparação é o extrato floral baseado em clorofórmio (ch-FE). Armazenar a amostra na escuridão (para reduzir a degradação de luz) a 4 ° C até o uso experimental. Extrações de repetição com várias amostras para fornecer Replica (pelo menos 3 por tipo de amostra). 5. coleta de água da chuva de flores de mirtilo (BB rw-FE)16 Nota: O dispositivo de recolha de águas pluviais floral mirtilo consiste de um copo de pulverizador ar injetor de pulverizador pintura descartável com adaptador de conexão (Copa: BSP, adaptador: rosca macho/macho), tubos de centrífuga de 50 mL (polipropileno), parafilm e fios revestidos de plástico ( telefone padrão fio, conteúdo de vertente individual fio interno). Selecione vários locais dentro de um arbusto de mirtilo para capturar executada fora flores antes da criação de dispositivos de captação de água de chuva. Estes incluem diretamente sob inflorescências (flor) para a mesma base da sarça (coroa). Registro diâmetro das hastes (variando de 1 a 5 cm) em locais selecionados, como isso vai ditar o tamanho dos buracos utilizados para fixação do dispositivo, descrita abaixo. Para cada local selecionado crie um dispositivo de recolha. Primeiro faça um furo no fundo de um copo de pulverizador (onde a Copa curvas para a abertura de rosca) para o correspondente diâmetro do caule, com um passo-bit ligado a uma imprensa de broca. Em seguida, corte uma linha reta do topo da solitária para a boca do copo pulverizador. Broca 4 furos equidistantes (grandes o suficiente para fio o fio revestido plástico), na foz da Copa do pulverizador e anexar a uma das extremidades dos fios revestidos plásticos deixando uma extremidade livre. Um buraco grande o suficiente para o adaptador de Copa de pulverizador de tinta da linha em uma tampa de tampa de centrífuga de 50 mL. Selo de segmentos de adaptador com parafilm para evitar fugas. Este fixe a tampa centrífuga e a parte rosqueada da Copa do pulverizador. Prenda o tubo de centrífuga de 50ml acasaladas. Repita as etapas 5.3-5.4 para criar vários dispositivos como por locais seleccionados, um mínimo de dispositivos de recolha 4 por local de amostragem. Implante dispositivos em locais selecionados flexionando copos de pulverizador para caber em hastes. Oriente o lado do corte da Copa do pulverizador para cima usando os fios revestidos de plástico ligados a outras hastes (para segurar a água passando por cima de flores é capturada). Apor parafilm quaisquer aberturas que poderiam vazar a água da chuva. (Supplemental Figura 3 suplementar Figura 4, suplementar Figura 5e suplementar Figura 6). Tubos de colheita de rótulo com implantação de data / hora. Após um evento de chuva, remover e substituir a parte inferior (tubo) do tubo (rótulo data / hora da coleção). Trazer coleções de escoamento (referidas como extrato de mirtilo águas pluviais floral (BB rw-FE)) dentro e vácuo filtro (filtração descrito em etapas 2.4-2.5). Loja como acima (passo 2.6), até que usei em um bioensaio à base de água. 6. coleta de água da chuva de flores de Cranberry (CB rw-FE) O dispositivo de recolha de águas pluviais floral em cranberry consiste de um funil polipropileno 7 X 7 cm, tubos de centrífuga de 50 mL (polipropileno), parafilm, e 4 padrão, plástico revestido laços de torção (por dispositivo). Primeiro, o calor punção 8 furos equidistantes (diâmetro de laços de torção) ao redor da boca do funil usando uma sonda de metal. Laços de torção Insira 4 furos. Afixe as outras pontas para local oposto dos furos que, formando um padrão de cruzamento perfeito. Enrole para baixo-haste de funil com parafilm e reserve. Um buraco grande o suficiente para inserir o funil para baixo-tronco em um boné de centrífuga de 50 mL com um pouco de passo. Insira a tampa da centrífuga, funil preparado. Repita as etapas 6.2-6.3 para criar dispositivos múltiplos, um mínimo de dispositivos de recolha 4 por local de amostragem. Implante dispositivos etiquetados (data/hora) para pântano amora selecionado. Ordenadamente aconchegar duas flor rolamento inflorescências (conhecidas como verticalidades) sob os laços de torção plásticos cruzados. Então verticalmente Oriente o dispositivo perfurando o tubo de centrifugação para o dossel amora (Supplemental figuras 7-8, suplementar Movie 3). Após a precipitação ou sobrecarga de irrigação remover e substituir a parte inferior (tubo) do tubo (rótulo data / hora da coleção). Trazer o escoamento (referido como extrato de águas pluviais amora floral (CB rw-FE)) dentro e vácuo filtro (filtração descrito em etapas 2.4-2.5). Loja como acima (passo 2.6), até que usei em um bioensaio à base de água. 7. bioensaio usando água com base em extratos florais15,16 (ativo-FE, passar-FE, FE-rw) Nota: Consulte a Figura 1. Este bioensaio é preparado em uma capa de fluxo Laminar. Preparar materiais: enxágue triplo as lamelas de vidro com 95% EtOH e ar seco, em seguida colocar de lado. Corte discos de toalha de papel para o diâmetro interno de um pratos de cultura celular de plástico padrão (9 cm). Coloque 2 camadas de discos de papel dentro de pratos de cultura e mergulhe com 2ml SDW. Prepare pelo menos 5 mL de um 1.0 X 105 conídios / mL de SDW suspensão de esporos (c. fioriniae) como por acima (passo 1.2-1.4), reservados. Em seguida, Misture volumes iguais de SDW e extrato floral à base de água em 2 mL microcentrifuge tubos. Em seguida, adicionar um volume igual da suspensão de esporos aos tubos de microcentrifuga de 2ml preparado (SDW mais FE); a preparação resultante é referida como uma mistura de tratamento aquoso. Para o controle, omitir parte FE e substitua SDW, para manter concentrações conidiais consistente.Nota: o tamanho da parcela é dependente do número de repetições e tempo-pontos. Normalmente, porções não exceda 500 µ l. Uma vez conídios e FE são combinados o bioensaio começou, após inoculação de 0 h. Coloque as lamelas de vidro previamente limpos em cima as toalhas de papel embebido dentro do prato de cultura de células. Coloque uma gota de 40 µ l da mistura aquosa tratamento no centro de uma lamela. Repita para tratamentos desejados, incluindo o controle, feche a placa de cultura de células. Repita em pratos de cultura celular separado para replicações (pelo menos 3) e os pontos de tempo (cada prato é para 1 ponto de tempo). Uma vez que o fornecimento de todos os tratamentos e repetições, colocar todos os pratos de cultura celular replicada em um recipiente plástico selado (30 x 13 x 7 mm) e incube a 25° C, no escuro. Nos pontos de tempo pré-determinado, adicionar 10 µ l de um fixador como algodão-azul de lactophenol (cristais de fenol 20,0 g, o ácido láctico de 20,0 mL 2,5%, glicerol 40,0 mL, 0,05 g algodão azul) para as gotas, impedindo o crescimento e semi preservando a montagem. Espere 2h para coletar o ponto de tempo de 0 h como este permite conidiais aderência à superfície de vidro, mas não é tempo suficiente para a germinação conidiais. Para todos os outros pontos de tempo, adicione o fixador na hora correspondente. Uma vez que foi adicionado um fixador, cuidadosamente inverta as lamelas, colocando-os lado da gota para baixo em um vidro de microscópio para facilitar o exame microscópico (1 lamela por slide). Quando todas as lamelas são nas corrediças de vidro de microscópio, deixá-los para resolver e parcialmente seco do capuz de fluxo por 20 min. Contagem de todos os conídios (totais conídios) presentes na lamela (conídios primários, germinados conídios e recém-formado conídios secundários) bem como apressórios ou 400 X ampliação (contando 16 campos) ou 200X (contando 4 campos), totalizando uma área de 3,808 mm 2. replicar todo bioensaio para análise estatística. Para os ensaios usando FE à base de água, analisar os dados, conforme descrito em Waller et al 201716, exibindo normalmente como média contagem/mm2 (conídios totais ou apressórios). 8. bioensaio usando baseado em clorofórmio extrai Floral (ch-FE)17 Nota: Consulte a Figura 2. Preparar materiais e pratos da cultura como por (passos 7.1) acima da pilha. Além disso, um número igual de Van Tieghem células (VanT.) enxaguar (8 mm de diâmetro externo, 6 mm ID) lamelas, bem como uma pipeta de vidro (1 mL com incrementos de 1 µ l) dentro de uma coifa, (duas vezes com 95% EtOH então duas vezes com clorofórmio) e reserve. Na capa do fluxo laminar, usando um tubo de microcentrifugadora 2 mL adicionar dois volumes iguais (pelo menos 500 porções µ l) de SDW e 1 volume de suspensão de esporos, então Reserve. Esta é a mistura de tratamento aquoso para bioensaios ch-FE. Em uma coifa, coloque um VanT. célula em uma lamela de vidro dentro do prato de cultura celular de plástico preparado. Dispensar (pipeta de vidro) 33 µ l de ch-FE desejado para o centro da célula T. Van (não toque as paredes do VanT. Celular; para o tratamento de controle, adicionar clorofórmio virgem) e deixe para secar. Repita em pratos de cultura celular separado para replicações (pelo menos 3). Uma vez que ch-FE tem secado, dispense 99 µ l da mistura preparada tratamento aquosa com uma pipeta padrão em centro do VanT. célula e, em seguida, fechar todos os pratos de cultura de células. Uma vez que a mistura de tratamento aquoso tem entrar em contato com os tratamentos secos ch-FE, o bioensaio começou, após inoculação de 0 h. Uma vez que o fornecimento de todos os tratamentos e repetições, colocar todos os pratos de cultura de pilha (fechado) em um recipiente plástico selado (30 x 13 x 7 mm) e incube a 25° C, no escuro. Nos pontos de tempo pré-determinado, adicione 15 µ l de um fixador (lactophenol algodão-azul) para o VanT. célula e deixe descansar pelo menos 5 min garantir adequada mancha fúngica. Após esse tempo, Retire cuidadosamente o VanT. cela e siga os passos de aquisição inversão e dados lamela acima (medidas 7.5-7,6). Para análise de dados, siga os métodos descritos em 2015 Gager17, normalmente, exibindo dados como formação de apressório, qual é a proporção de conídios totais de apressórios contados na área observada (3,808 mm2). 9. amora baseada na fenologia extrações17 Mão recolher flores de amora (em junho; 100 g), imaturos de fruta (duas vezes; Julho e agosto; 200 g) e amadurecer a fruta amora na colheita (outubro; 200 g), colocar em sacos de plástico de tamanhos adequado e refrigerar a 4 ° C, imediatamente após a colheita. Use as precauções de contaminação descritas acima (passo 2.1).Nota: Haverá material extra planta coletada em cada momento, mas estes montantes precaver-se contra a extração de ovários infectados obviamente fúngicos e frutas (mostrando os sinais e sintomas da doença). Antes da extracção, remover qualquer flores deterioradas, danificados, doentes, em seguida, usando flores só saudáveis, remover as sépalas, pedúnculos, corolas, estigmas, estilos e estames com pinça curvada (pinça de 45 °) e descartar tudo, mas os ovários. Uma vez que os ovários são coletados, realizar a extração baseado em clorofórmio em um 1 wt: 9 relação de vol (detalhados em etapas 4.2-4.4, usando apenas os ovários). Armazenar as amostras até que todas as outras extrações são completas, ou seja, até a condutância de bioensaio. Uma vez que os frutos são coletados, realizar uma extração baseado em clorofórmio (passos 4.2-4.4, usando frutas coletadas em vez de flores), mas adicionem 10 g de fruta para 90 mL de clorofórmio e uma vez extraído, deixe a solução evaporar a 9 mL (resultando em um peso de 9 mL 10 g: : solução vol). Fazer extrações de frutas imediatamente após a coleta em julho, agosto e outubro. Armazenar conforme acima (passo 4.4) até que todas as extracções são coletadas. Após a última extração de frutas baseado em clorofórmio, sujeitar todos os extractos de clorofórmio baseada no direito penal coletados para este ensaio para o bioensaio baseado em clorofórmio e analisar adequadamente (etapas 8.1-8,6).