Colletotrichum fioriniae Ontwikkeling in Water en Chloroform gebaseerde Blueberry en Cranberry Floral extracten

1. schimmel isolaten en Spore schorsingen Colletotrichum fioriniae isoleren van een natuurlijk besmette gastheer19. Sla de schone culturen op maïsmeel agar (CMA) schuin. Plaats de stekker van de cultuur (van CMA inslag) op een standaard plastic cel cultuur schotel (9 cm diameter) met die een V8 sap agar (cV8A) (gewijzigd van Miller-1955), of niet-verduidelijkt V8 sap agar (V8A)20verduidelijkt. Wanneer kolonies begint te sporulate, strijk conidiën (oranje conidial massa) naar een ander cV8A of V8A met cel cultuur schotel (met een standaard steriele lus) voor de productie van een high-density Sporulerende cultuur.Opmerking: Elk protocol stappen met schimmels moeten worden uitgevoerd in een laminaire flow kap om de mogelijkheid van besmetting van schimmel culturen en/of bioassays. Na 7 dagen van de groei, met behulp van een standaard steriele lus een kleine hoeveelheid conidiën ophalen over de high-density cultuur (door het licht aanraken van de lus naar de conidial massa) en roer dit in een tube van 15 mL centrifuge met 10 mL steriel gedeïoniseerd water (SDW). Vortex in dit voorbeeld voor 10 s, vervolgens met behulp van een standaard pipet duik op en neer talloze malen aan verdere mix het monster. Dan, breng een druppel van het monster van de vortexed op de hemocytometer en de raming van de spore concentraties. Graaf 5-10 velden op de hemocytometer, het gemiddelde verkrijgen en gemiddelde te vermenigvuldigen met de passende verdunningsfactor (d.w.z. 10.000), aldus het verkrijgen van de conidial concentratie per mL SDW. Vervolgens met behulp van een volume (V) / concentratie (C) vergelijking (V1● [C1] = V2● [C2]) aanpassen (met SDW) 1,0 X 105 conidiën per mL SDW met een eindvolume van 5 mL. Dit wordt aangeduid als de entsuspensie en alleen onmiddellijk vóór gebruik in beide bioassay is gemaakt. 2. actieve, waterbasis Floral extracten (actieve -FE)15,16 Opmerking: Zie aanvullende figuur 1, aanvullende figuur 2, aanvullende figuur 3en aanvullende film 1. Zorgvuldig hand-verzamelen bosbes (April-mei) en cranberry (juni-juli) bloemen tijdens de bloei van hun respectieve piek in het veld (aanvullende figuur 1). Draag en wijzigen van nitril handschoenen tussen bemonstering locaties (rassen/variëteiten/fysieke locaties) te remmen van menselijke huid olie verontreiniging, alsmede het Kruis besmetting tussen floral variëteiten. Plaats van de bosbessen of cranberry bloemen (uit een enkele bron) in plastic zakken (Vul een tas 100 x 150 mm) en onmiddellijk koelkast bij 4 ° C, zodra de bloemen zijn verzameld.Opmerking: De actief – extractie uit Leandro et al.is gewijzigd. (2003) 16. Voorafgaand aan de winning, Verwijder eventuele verslechterde, beschadigde, zieke bloemen, dan met behulp van gezonde bloemen verwijderen van de eierstokken, de kelkbladen en de steeltjes met een gebogen Tang (45˚ pincet) en negeren. Gebruik alleen de overige organen (corolla, stigma, stijl en meeldraad) voor actieve- extracties uit te voeren. Knippen kaasdoek (150 x 150 mm) en plaatsen binnen een 7 x 7 mm-trechter, plaats in een centrifugebuis schone 50 mL en gereserveerd. Combineren van 1 deel bloemen tot 9 delen SDW verwerkt (1 wt: 9 vol verhouding) in een mortier. Voorzichtig slijpen met een stamper voor 30 s (zorg aan de monsters niet volledig te verpulveren). Stam resulterende pulp door bereid kaasdoek/trechter en verzamelen in de centrifugebuis (50 mL). Schoon of gebruik nieuwe mortel/stamper tussen elke extractie met 95% EtOH en warm stromend water. Bereiden van een vacuüm filtratie apparaat: verzamelen Buchner trechter, vacuüm filter conische kolf (maximaal 1000 mL capaciteit) 55 mm cirkel filtreerpapier en vacuüm slang/bron. Filtreerpapier toevoegen aan een passende formaat Buchner trechter en plaats bovenop de kolf dan apparaat verbinden met een water / zuignap bron via vacuümslang en zet opzij. Verduidelijken de floral extracten van bosbessen door gedurende 10 minuten bij 8,055 x gcentrifugeren. Giet af supernatant in bereid vacuüm filter apparaat, zet vacuüm, bovendrijvende vloeistof filteren, dan giet inhoud van de kolf in een nieuwe centrifugebuis (50 mL). Reinig alle onderdelen van het apparaat tussen elke filtratie met 95% EtOH en warm stromend water. Verder filteren door middel van een spuit aangepast met een 0,22 µm poriegrootte, acetaat steriliseren, filter in een nieuwe centrifugebuis (50 mL). Voor de cranberry floral extracten, enige vacuüm filteren door filterpapier en giet inhoud van de kolf in een nieuwe centrifugebuis (50 mL). Resulterende voorbereiding wordt aangeduid als actieve- floral extract (actieve -FE). Bewaren alle waterbasis floral extracten (actieve- passieve-, regenwater collecties) bij-20 ° C in 5-50 mL aliquots tot experimenteel gebruik. Herhaal extracties uit te voeren met meerdere monsters (ten minste 3 extracties per monster type) om wordt gerepliceerd. 3. passief , waterbasis Floral extracten ( pass -FE) 16 Opmerking: Zie aanvullende film 2. Hand verzamelen hele blueberry bloemen (50 g) zoals hierboven, en na het verzamelen van koel. Voorafgaand aan de winning, Verwijder eventuele verslechterde, beschadigde, zieke bloemen en alleen de steeltjes van intact bloem. Koelkast bereid monsters totdat het passief – extractie systeem, hieronder beschreven, in de plaats is. Spoel alle onderdelen vóór gebruik met 95% ethanol (EtOH) en warm stromend water om te voorkomen dat besmetting (netwave blad, twee netwave manden, glas brood pan en pomp mist fles). Ook bereiden een 4 laag kaasdoek/trechter/50 mL centrifugebuis voor elke extractie zoals hierboven beschreven (in stap 2.2), en de braaklegging. Voorbereiden van de zeef: Leg een netwave vel (aka doorzichtig bar matten) in één netwave mand (114 x 102 mm). Plaats een tweede, identieke, mesh mand ondersteboven (omgekeerde) in een glas brood-pan (127 x 229 mm) (om de bloemen zitten in SDW) en plaats de Maas sheet met mand bovenop. Voeg 50 g van de voorbereide bloemen in de zeef.Opmerking: U kunt ook kleine reageerbuis [zuivering] manden kunnen worden gebruikt in plaats van de oorspronkelijk gebruikte netwave manden (oude, groene aardbei mesh pint manden zijn vaak moeilijk te bron). Gelijkmatig mist bloemen met 250 mL met behulp van een pomp fles mist en afvoer in de glazen brood-pan vast te leggen. Vervolgens stam filtraat door de bereid kaasdoek/trechter in een schone centrifugebuis. Resulterende voorbereiding wordt aangeduid als passief- floral extract (pass -FE); opslaan als per boven (stap 2.6). Reinig alle onderdelen tussen elke extractie met 95% EtOH en warm stromend water. Herhaal extracties uit te voeren met meerdere monsters te verstrekken wordt gerepliceerd (ten minste 3 per monster type). 4. chloroform gebaseerde Floral extracten (ch-FE) 17 Bosbes en cranberry bloemen als per boven (stap 2.1) verzamelen en bereiden van bloemen voor extractie (stap 2.2, zonder kaasdoek/trechter voorbereiding). Houd bereide bloemen gekoeld tot vóór gebruik. Geen werk uitgevoerd met chloroform moet worden uitgevoerd in een zuurkast om veiligheidsredenen. Dit omvat voorbereiding van materialen / glaswerk, extractie procedures en bioassay huidgeleiding (stappen met behulp van ch-FE). Reinigen van alle onderdelen met 95% EtOH tweemaal en vervolgens tweemaal met chloroform om te voorkomen dat besmetting voor elke extractie: threaded glazen cultuur buizen, 2 glazen bekers, klein RVS scherm en een [glas] afgestudeerde cilinder. Gereserveerd voor droge ondersteboven. Spoel van polytetrafluorethyleen (PTFE) bekleed caps tweemaal met 95% EtOH alleen (chloroform beschadigt de buitenste materialen van het GLB) en zet opzij om te drogen. Combineren van 1 deel verwerkt bloeit tot 9 delen chloroform (1 wt: 9 vol verhouding) in een bekerglas (bloemen dan chloroform), zachtjes swirl voor 30 s, en druk via een RVS-scherm in het bekerglas van de tweede. Ch-FE uit het tweede bekerglas giet in de glazen buis voor cultuur (10-15 mL) en brengt het GLB PTFE. Wikkel het GLB met parafilm ter voorkoming van verdamping. Deze voorbereiding is het chloroform gebaseerde floral extract (ch-FE). Monster in duisternis (om aantasting van het licht) bij 4 ° C tot experimenteel gebruik opslaan. Herhaal extracties uit te voeren met meerdere monsters te verstrekken wordt gerepliceerd (ten minste 3 per monster type). 5. verzameling van regenwater van Blueberry bloemen (BB rw-FE)16 Opmerking: Het apparaat blueberry floral regenwater collectie bestaat uit een lucht spuitpistool wegwerp verf spray cup met verbinding adapter (cup: binnendraad, adapter: male-male draad), 50 mL centrifuge buizen (polypropyleen), parafilm en kunststof gecoate draden () standaard telefoonsnoer, individuele interne draad onderdeel inhoud). Selecteer meerdere locaties binnen een bosbes bush te vangen regenwater aanloop van bloemen vóór het maken van de stroomafname-inrichtingen. Deze omvatten direct onder bloeiwijzen (bloem) aan de basis van de bush (kroon). Record diameter van de stammen (variërend van 1-5 cm) op geselecteerde locaties, als dit zal bepalen de grootte van de gaten gebruikt voor apparaat bevestiging, die hieronder worden beschreven. Maak een collectie apparaat voor elke geselecteerde locatie. Boor een gat aan de onderkant van een kopje van de spray (waar de cup buigt naar de schroefdraad opening) met de bijbehorende diameter van de stam, eerst met een stap-bits gekoppeld aan een boor-pers. Knip dan, een rechte lijn vanaf de bovenkant van de thehole tot de monding van de spray-cup. Boorgaten 4 equidistante (groot genoeg om draad de plastic gecoate draad), aan de monding van de spray-cup, en sluit één uiteinde van de plastic gecoate draden videoconnectors gratis verlaten. Boor een gat groot genoeg om de schroef van de verf adapter voor de kop van de sproeier in een 50 mL centrifuge GLB deksel. Adapter threads met parafilm om te voorkomen dat lekkende afdichting. Sluit dit aan zowel de centrifuge GLB en schroefdraad gedeelte van de sproeier cup. Bevestig de centrifugebuis erop 50 mL. Herhaal stappen 5.3-5.4 om meerdere apparaten per geselecteerde locaties, een minimum van 4 stroomafname-inrichtingen per bemonstering locatie maken. Implementeren apparaten op geselecteerde locaties door het buigen van de sproeier bekers om te passen op de stengels. De besnoeiing-kant van de spray-beker omhoog met behulp van de kunststof beklede draden aangesloten op andere stengels (om te verzekeren het water passeren over bloemen is opgevangen) oriënteren. Brengt parafilm alle openingen die regenwater lekken kunnen. (Aanvullende figuur 3, aanvullende figuur 4, aanvullende figuur 5en aanvullende figuur 6). Label collectie buizen met implementatie datum / tijd. Na een regen-event, verwijder en vervang het bodemgedeelte (buis) van de centrifugebuis (label van datum / tijd van collectie). Afvoer collecties (bosbes regenwater floral extract (BB rw-FE) genoemd) binnen brengen en vacuüm filter (filtratie beschreven in stappen 2.4-2.5). Winkel als hierboven (stap 2.6), totdat in een bioassay waterbasis gebruikt. 6. verzameling van regenwater van Cranberry bloemen (CB rw-FE) De bloemen regenwater collectie apparaat in cranberry bestaat uit een polypropyleen trechter van 7 X 7 cm, 50 mL centrifuge buizen (polypropyleen), parafilm, en 4 standaard, kunststof bekleed twist banden (per apparaat). Eerst, warmte doorprikken 8 equidistante gaten (diameter van twist banden) rond de monding van de trechter met een metalen sonde. Draai banden invoegen met 4 gaten. Sluit de andere uiteinden aan dat gaten tegenovergestelde locatie, vormen een nette overschrijding patroon. Trechter down-stam met parafilm wrap en zet opzij. Boor een gat groot genoeg is voor het invoegen van de trechter down-stam in een 50 mL centrifuge dop met een stap-bits. Bereid trechter invoegen in het GLB centrifuge. Herhaal stap 6.2-6.3 om meerdere apparaten, een minimum van 4 stroomafname-inrichtingen per bemonstering locatie maken. Implementeren gelabelde (datum/tijd) apparaten in de geselecteerde cranberry moerassen. Netjes plooi twee bloem dragende bloeiwijzen (ook wel staanders genoemd) onder de gekruiste kunststof draai-banden. Verticaal oriënteren dan het apparaat door de centrifugebuis piercing in de cranberry luifel (aanvullende figuren 7-8, aanvullende Movie 3). Na regenval of overhead irrigatie Verwijder en vervang het bodemgedeelte (buis) van de centrifugebuis (label van datum / tijd van collectie). Afvoer (cranberry regenwater floral extract (CB rw-FE) genoemd) binnen brengen en vacuüm filter (filtratie beschreven in stappen 2.4-2.5). Winkel als hierboven (stap 2.6), totdat in een bioassay waterbasis gebruikt. 7. de bioassay met behulp van Water gebaseerd Floral extracten15,16 (actieve-FE, pass-FE, rw-FE) Opmerking: Zie Figuur 1. Deze bioassay wordt bereid in een laminaire flow-kap. Bereiden van de materialen: triple spoelen glas coverslips met 95% EtOH en lucht droog, dan opzij te zetten. Gesneden papier handdoek schijven aan de binnendiameter van een standaard plastic cel cultuur gerechten (9 cm). Plaatsen van 2 lagen papier schijven binnen cultuur gerechten en geniet met 2 mL SDW. Bereiden ten minste 5 mL van een 1.0 X 105 conidiën per mL SDW de entsuspensie (C. fioriniae) als per boven (stap 1.2-1.4), gereserveerd. Hierna sloeg Meng gelijke hoeveelheid SDW en waterbasis floral extract in 2 mL microcentrifuge buizen. Dan, voeg een gelijk volume van de entsuspensie aan de bereid 2 mL microcentrifuge buizen (SDW plus FE); de resulterende voorbereiding is een waterige behandelingsmengsel genoemd. Voor het besturingselement, FE gedeelte weglaten en vervangen door SDW, conidial concentraties om consistent te houden.N.B. de portiegrootte is afhankelijk van aantal replicatieonderzoeken en tijd-punten. Meestal gedeelten niet meer dan 500 µL. Zodra conidiën en FE worden gecombineerd is de bioassay begonnen, 0 h na inoculatie. Plaats de coverslips vooraf gereinigd glas bovenop de doorweekte papieren handdoeken binnen de cel cultuur schotel. Plaats een droplet 40 µL van waterige behandelingsmengsel in het midden van een dekglaasje aan. Herhaal voor gewenste behandelingen, met inbegrip van het besturingselement, de cel cultuur schotel sluiten. Herhaal in aparte cel cultuur gerechten voor replicaties (ten minste 3) en tijd punten (elk gerecht is voor 1 punt van de tijd). Zodra alle behandelingen en replicaten hebben is afgezien, plaats alle gerepliceerde cel cultuur gerechten in een verzegelde plastic container (30 x 13 x 7 mm) en Incubeer bij 25° C in het donker. Op vooraf bepaalde tijdstippen, voeg toe 10 µL van een hechtmiddel als lactophenol katoen-blauw (20,0 g fenol kristallen 20,0 mL 2,5% melkzuur, 40.0 mL glycerol, 0,05 g katoen blauw) aan de druppels, stoppen van groei en semi-behoud de mount. Wacht 2 h voor het verzamelen van de punt van de tijd 0 h zoals dit conidial hechting op het glasoppervlak kan maar niet lang genoeg voor conidial kiemkracht is. Voor alle andere tijdstippen, fixeerspray overeenkomstige keer toevoegen. Zodra een hechtmiddel istoegevoegd; omkeren zorgvuldig de coverslips, plaatsen hen druppel zijde naar beneden op een microscoopglaasje van glas om microscopisch onderzoek (1 dekglaasje aan per dia). Wanneer alle coverslips op de glazen Microscoop dia’s zijn, laat ze te regelen en gedeeltelijk droog in de kap van de stroom voor 20 min. Graaf die alle conidiën (totale conidiën) presenteren op het dekglaasje aan (primaire conidiën, gekiemd conidiën en nieuw gevormde secundaire conidiën) evenals apressoria op beide 400 X vergroting (tellen 16 velden) of 200 X (tellen 4 velden), totaal een oppervlakte van 3.808 mm 2. repliceren hele bioassay voor statistische analyse. Voor tests met behulp van watergebaseerde FE, analyseren gegevens zoals beschreven in Waller et al. 201716, meestal weergeven als gemiddelde graaf/mm2 (totale conidiën of apressoria). 8. de bioassay met behulp van Chloroform gebaseerde Floral extracten (ch-FE)17 Opmerking: Zie Figuur 2. Bereiden van materialen en cel cultuur gerechten als per boven (stappen 7.1). Bovendien spoelen een gelijk aantal Van Tieghem cellen (Goodness. cellen) (8 mm OD, 6 mm ID) coverslips, evenals een glazen pipet (1 mL met 1 µl stappen) in een zuurkast (tweemaal met 95% EtOH vervolgens tweemaal met chloroform), en zet opzij. Laminaire flow Hood, met behulp van een tube van 2 mL microcentrifuge twee gelijke delen (ten minste 500 µL gedeelten) van SDW en 1 deel van de entsuspensie toevoegen, dan opzij. Dit is het waterige behandelingsmengsel voor ch-FE bioassays. Plaats een Goodness in een zuurkast. cel op een glas dekglaasje aan binnen de bereid kunststof cel cultuur schotel. Afzien (met glazen pipet) 33 µL van gewenste ch-FE in het midden van de cel Van T. (raak niet de muren van de Goodness. Cel; voor de behandeling van de controle, voeg Maagd chloroform), en laten drogen. Herhaal in aparte cel cultuur gerechten voor replicaties (ten minste 3). Zodra de ch-FE is gedroogd, afzien van de 99 µL van het behandelingsmengsel bereid waterige met een standaard pipet in het midden van de Goodness. cel, dan sluiten alle celopmaak cultuur gerechten. Zodra het waterige behandelingsmengsel gekomen in contact met de gedroogde ch-FE-behandelingen, is de bioassay begonnen, 0 h na inoculatie. Zodra alle behandelingen en replicaten hebben is afgezien, plaats alle (gesloten) cel cultuur gerechten in een verzegelde plastic container (30 x 13 x 7 mm) en Incubeer bij 25° C in het donker. Op vooraf bepaalde tijdstippen, voeg toe 15 µL van een fixeer (lactophenol katoen-blauw) aan de Goodness. cel en laat zitten voor minstens 5 min om te verzekeren dat voldoende schimmel vlekken. Na die tijd, verwijder voorzichtig de Goodness. cel en stappen dekglaasje aan inversie en data acquisitie boven (stappen 7.5-7.6). Voor data-analyse, volg in Gager 201517, meestal gegevens weergeven als appressorium formatie, die is de verhouding van totale conidiën te apressoria geteld in het gebied waargenomen (3.808 mm2) beschreven methoden. 9. cranberry fenologie gebaseerde extracties17 Hand cranberry bloemen verzamelen (in juni; 100 g), onrijp fruit (tweemaal; Juli en augustus; 200 g), en volwassen cranberry fruit bij de oogst (oktober; 200 g), plaats in de gepaste afmetingen plastic zakken en koelkast bij 4 ° C onmiddellijk na het verzamelen. Gebruik de besmetting voorzorgsmaatregelen hierboven (stap 2.1) beschreven.Opmerking: Er worden extra plantaardig materiaal verzameld op elk moment, maar deze bedragen hoeden uitpakken natuurlijk schimmel geïnfecteerde eierstokken en fruit (het tonen van symptomen en tekenen van ziekte). Voorafgaand aan de winning, Verwijder eventuele verslechterde, beschadigde, zieke bloemen en vervolgens met behulp van alleen gezonde bloemen, verwijder de kelkbladen, bloemen, corollas, stigma’s, stijlen en meeldraden met gebogen pincet (45 ° pincet) en gooi alle, maar de eierstokken. Zodra de eierstokken worden verzameld, voeren de chloroform gebaseerde extractie bij een 1 wt: 9 vol verhouding (Zie stappen 4.2-4.4, alleen eierstokken). Monsters opslaan totdat alle andere extracties voltooid zijn, dat wil zeggen tot bioassay geleidbaarheid. Eenmaal fruit verzameld worden, uitvoeren van een extractie van chloroform gebaseerde (in stappen van 4.2-4.4, gebruikend verzamelde fruit in plaats van bloemen), maar Voeg 10 g fruit tot 90 mL chloroform en eenmaal gewonnen, kunnen de oplossing te laten verdampen tot 9 mL (wat resulteert in een 10 g: 9 mL wt : vol oplossing). Maak fruit extracties onmiddellijk na het verzamelen in juli, augustus en oktober. Opslaan als per boven (stap 4.4) totdat alle extracties worden verzameld. Na de laatste vruchten chloroform gebaseerde extractie, onderwerpt alle Penologie gebaseerde chloroform extracten verzameld voor deze bepaling aan de bioassay chloroform gebaseerde en dienovereenkomstig analyseren (stappen 8.1-8.6).