Colletotrichum fioriniae Entwicklung in Wasser und Chloroform-basierte Heidelbeere und Cranberry Floral Extrakte
Summary
Hier werden Bioassays zur Überwachung der Entwicklung der pilzliche Erreger, Colletotrichum Fioriniae, im Beisein von Heidelbeeren oder Preiselbeeren floral Auszüge auf Glasdeckgläser beschrieben. Wasser, Chloroform und Feld Regenwasser – basierte floral Extraktion, die Techniken detailliert sind, sowie Einblick, wie diese Information angewendet werden kann.
Abstract
Um die Phänologie der Blütezeit und die zeitliche Dynamik der floralen chemische Hinweise auf Pilz Obst verfault Krankheitserreger genau zu überwachen, wurden florale Extraktionsmethoden und Deckglas Bioassays entwickelt unter Verwendung Colletotrichum Fioriniae. In Heidelbeeren und Preiselbeeren ist dieser Erreger optimal gesteuert, durch die Anwendung von Fungiziden während der Blütezeit wegen Blumen Rollenspiel in den ersten Stadien der Infektion. Das Protokoll hier detailliert beschreibt, wie florale Extrakte (FE) mit Wasser, Chloroform und Regenwasser-basierte Feldmethoden zur späteren Verwendung in entsprechenden Glas Deckglas Bioassays stammen. Jede FE serviert, einen anderen Satz von Informationen bereitzustellen: Antwort von C. Fioriniae mobilisiert floral chemischen Queues in Wasser (wasserbasiert), Erreger Reaktion auf Blüte und Frucht Oberfläche Wachse (Chloroform-basiert) und Feld-basierte Überwachung der floral Regenwasser, Umzug in-vitro- Beobachtungen in einer landwirtschaftlichen Umgebung gesammelt. Die FE ist allgemein als entweder Wasser oder Chloroform-basierte, mit einer entsprechenden Bioassay beschrieben als Ausgleich für die angeborene Unterschiede zwischen diesen beiden Materialien beschrieben. Regenwasser, das aus Blumen gelaufen wurde in einzigartige Geräte für jede Ernte in Anspielung auf die Flexibilität und die Anwendung dieses Ansatzes für andere Anbausysteme. Die Bioassays sind schnell, kostengünstig, einfach und bieten die Möglichkeit, räumlich-zeitliche und ortsspezifische Informationen über das Vorhandensein der stimulierende floral Verbindungen aus verschiedenen Quellen zu erzeugen. Diese Informationen letztendlich informieren besser Disease-Management-Strategien, wie FE verringern den Zeitaufwand für Infektion auftreten, so Einblicke in veränderten Risiken für Erreger Infektion über die Vegetationsperiode.
Introduction
Colletotrichum Fioriniae verursacht eine Fruchtfäule Schneeball Heidelbeere (Vaccinium Corymbosum L.) und der großen amerikanischen Cranberry (V. Macrocarpon Aiton)1,2. Dieser Erreger wurde vor kurzem von der C. Acutatum Arten komplexe3,4,5,6 abgegrenzt und ist eine kausale Heidelbeere Anthraknose-Agent und Mitglied der Cranberry Frucht rot Komplex, neben zahlreichen anderen Pflanzen Krankheiten weltweit7verursacht. C. Fioriniae hat eine latente, Hemibiotrophic Lebensstil8, mit Infektionen, die während der Blüte und Symptom Entwicklung nicht sichtbar, bis die Frucht in der Endphase der Reifung9sind. Fruchtfäule wird in Heidelbeeren und Preiselbeeren nur ausreichend mit Fungizidanwendungen, die während der Blütezeit gesteuert. Der Erreger überwintert in ruhenden Heidelbeere floral Knospe Skalen10 und sporulates während der Blüte. Konidien werden in den Baumkronen über regen-Splash Zerstreuung11,12 und Inokulum Aufbau wurde stark an die Blüte Periode13korreliert. Antwort von Colletotrichum Arten auf Host Blumen gilt nicht nur für Vaccinium, wie Blumen wichtige Komponenten der Zitrusfrüchte Post Blüte Frucht sind (PFD)14 sowie Erdbeer Anthraknose15, in beiden Fällen verursacht ablegen der Erreger, sporulate. Allen diesen Fällen unterstreichen die Notwendigkeit für effektive Methoden zur Beurteilung der zeitlichen Dynamik des floralen chemische Signale auf C. Fioriniae und andere Krankheitserreger, die während der Blüte zu infizieren. Die Einsichten, die durch die hier beschriebenen Methoden werden immer wertvoller.
Dieses Protokoll beschreibt Methoden der floralen Extrakt (FE) Beschaffung und führt die Auswertung der C. Fioriniae Reaktionen auf FE über Glas Deckglas Bioassays15,16. Die floralen Extraktionstechniken werden in zwei Haupttypen unterteilt; wässrige Extraktionen (aktiv-FE, passive (Pass –FE) und Feld Regenwasser-basierte (Rw-FE)), und Chloroform-basierte (ch-FE)17 Extraktionen. Die wässrige Extraktionen ermöglichen für die Inspektion von Wasser mobilisiert floral chemische Signale. Diese mobilisiert Cues sind wahrscheinlich wichtige Bestandteile des Gerichts Infektion, da FE die Geschwindigkeit der Infektion16 erhöht, neben der Bereitstellung der Feuchtigkeit erforderlich für die Infektion auftreten. Darüber hinaus stellen sie einen natürlicheren Zustand als floral Stimulation in den Baumkronen bei Benetzung-Veranstaltungen wie zuvor in Heidelbeeren und andere Ernte Systeme14,16gewaschen werden kann. Chloroform-basierte florale Extraktionen (ch-FE) bieten auch wertvolle Informationen zu Erreger Reaktion auf Host Oberfläche17,18, Aufklärung der frühen Entwicklungsstadien der Konidien auf anfälligen einmal hinterlegt Wachse Host-Organe (z. B. Blumen, Eierstöcke und entwickelnden Frucht). Erreger als Reaktion auf saisonale Veränderungen in Host Oberfläche Wachse kann auch mit diesem Protokoll überwacht werden. Dementsprechend sind die Bioassays zugeschnitten auf die Zusammenarbeit mit wasserbasierten FE oder Chloroform-basierte FE um die angeborene Unterschiede zwischen diesen beiden Materialien zu mildern.
Von den Bioassays generierten Daten ergab, dass wässrige Extraktionen höhere Niveaus von sekundären Conidiation als Chloroform-basierte Extraktionen stimulieren gab es eine definitive Appressorial Antwort, daher Verwicklung mehrere Verbindungen in der FE vorhanden. Interessanterweise waren beide dieser Wachstum Antworten beobachtet, wenn die Nutzung von Regenwasser, die von Heidelbeere und Cranberry Blumen, zeigt mehrere stimulierende Verbindungen ausgeführt hatte von der Oberfläche der Blumen gewaschen werden können. So wird die Überwachung für florale Stimulation Einblick in die Erfolgswahrscheinlichkeit Erreger in ein landwirtschaftliches System bieten.
Das ultimative Ziel dieses Protokolls ist es, bieten eine Methode zur Erzeugung von biologischen Basisinformationen auf Pilz Pflanzenpathogene als Reaktion auf florale chemische Signale sowie initiierende Methoden, die diese floralen Informationen zur Unterstützung nutzen können standortspezifische Krankheitsprozesse Leitungs- und Entscheidungsstrukturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Erkennung der C. Fioriniae auf florale Extrakte (FEs) Bioassays wurden entwickelt für die Heidelbeere und Cranberry Frucht Rot Pathosystems aber an anderen Gartenbaukulturen leicht angepasst werden können. Das oben beschriebene Protokoll wurde erwerben viele wichtige Datensätze, darunter wertvolle, aber nicht beschränkt auf: FE Auswirkungen auf mehrere Isolate von zahlreichen Krankheitserregern, Zeitverlauf Informationen zu Pilzwachstum Stadien in Anwesenheit von verschiedenen FEs Vergleich der Extraktionstechniken, Überprüfung der einzelnen Chemikalien auf C. Fioriniae Wachstum und Differenzierung, Bewertung der einzelnen Blume Orgel extrahiert, Auswirkungen der Temperatur auf C. Fioriniae während in Gegenwart von FE, Effekte Phänologie abhängigen Wachs Extraktionen und floralen Regenwasser Effekte. Durch den Einsatz dieser Techniken hat Daten generiert auch ein viel klareres Verständnis von C. Fioriniae Leben inszeniert und teilweise erläutert, warum die Blütezeit so entscheidend für die Kontrolle über viele Früchte faulen Krankheitserreger ist.
Zunächst alle Blumen auf die aktiveidentisch verarbeitet wurden-FE, aber die Extraktion in Richtung unter Verwendung der ganze Blumen verschoben hat. Floral Dissektion war zeitaufwendig und hatte wenig Einfluss auf die Bioaktivität der daraus resultierenden FEs. Können jedoch einzelne Blütenorganen und haben wurde bewertet mit dieses Protokoll, aber großer Sorgfalt getroffen werden, um nicht vollständig die floralen Geweben (Supplemental Film 1, bei Vorsichtsmaßnahmen detailliert Schritt 2.3), Mazerat als dies unter Umständen freigegeben Pilze giftig/statische Verbindungen in der FE, die die mikroskopischen Bewertungen verfälschen könnte. Weniger invasive Extraktionen wie Pass –sind FE (Supplemental Movie 2) und Rw-FE jetzt günstiger wegen ihrer Leichtigkeit des Erwerbs. Darüber hinaus benötigen diese Extraktionstechniken nur Vakuumfiltration, biologisch aktiven floral chemische Signale zu erwerben.
Die Blumen in allen Extraktionen verwendet wurden in der Regel gekühlt für 0-3 Tage vor dem Auszug-Vorbereitung. Eine Herausforderung dieses Protokolls ist Zeitmanagement FE Umsatzes (Feldsammlung durch Speicherung von Auszügen). Dies wurde durch zahlreiche Proben aus unterschiedlichen Quellen und Termine verschärft. Gefrorene Blumen wurden nicht in echte Ausmaß, evaluiert, wie aufgetaute Blumen verschlechterten und verfärbt erscheinen. Jedoch sobald die wässrige FEs hergestellt worden sein, wiederholt Einfrieren und Auftauen, hat keine Wirkung gezeigt, auf die Bioaktivität der FE, so lange wie die FE sind schnell gefroren nach Bioassay Vorbereitung (tragfähige 3-jährige FE).
Chloroform-basierte Extraktion ermöglicht die Untersuchung der Erreger Antworten auf dreidimensionale Blumen/Früchte Oberfläche Wachse in einer zweidimensionalen Ebene über ch-FE Verdunstung am Glasdeckgläser. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass die tatsächliche Kristallstrukturen Wachse abgeschieden von der ch-FE identisch mit der Oberfläche sind aus denen sie erhoben wurden. Bedeutung, ergänzende Techniken sollten umgesetzt werden, wenn Pilz Reaktion auf spezifische Wachs Strukturen in Vivo der Schwerpunkt der Untersuchung sind. Chloroform-basierte Extrakte benötigen mehr Speicher Pflege als wässrige Extraktionen. Bewahrt, nicht nur die ch-FE Extrakte in der Dunkelheit die PTFE ausgekleidet Zellkultur tube Kappen und Parafilm Abdichtung wickeln müssen regelmäßig evaporative Dichtheit überprüft werden und bei Bedarf ersetzt.
Das Konzept der Überwachung floral Regenwasser wurzelt in der Idee der fortschreitenden ortsspezifische Krankheit Überwachungstools. Die Regenwasser-Sammlung-Geräte können auf viele andere Pflanze-Architekturen angepasst werden, so lange, wie der Sammelvorrichtung Regenwasser erfasst, die von Blumen ausgeführt hat. Dieser Ansatz bietet Informationen über ob florale Stimulation ist vor Ort zu einem bestimmten Zeitpunkt und in der gesamten Saison überwacht werden kann. Alternativ können Sammlung Geräte eingesetzt werden, an mehreren Standorten der Baldachin um festzustellen, wie weit floral Hinweise bei einem bestimmten Benetzung-Event gewaschen worden sind. In Zukunft werden Experimente, Rw-FE diktieren, wenn Fungizidanwendungen beginnen soll und wann sie sicher beenden können. Darüber hinaus ist durch die Überwachung der Phänologie abhängigen Wachs Extraktionen (Protokoll Abschnitt 9), wie wichtig es ist, dass die Blütezeit zur Biologie des Erregers noch deutlicher geworden. Dieser Abschnitt wurde auch aufgenommen, um demonstrieren die Flexibilität dieser Bioassays, Bereitstellung von Methoden, mit denen für Side-by-Side-Vergleich der Host Oberfläche Wachse, die zeitlich getrennt sind. Die Daten generiert mit floralen Extraktionstechniken und Bioassays stellen konkrete Indikatoren der Erreger Stimulation, spezifischen chemischen Klassen wichtig, Erreger Biologie und Ziele für die künftige Bekämpfungsstrategien.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken William S. Haines, Sr. ausgestattet Cranberry-Forschungsfonds und New Jersey Heidelbeere und Cranberry Research Council, Inc. für Unterstützung. Wir danken auch Jennifer Vaiciunas (Anleitung und floralen Zubereitungen), Christine Constantelos (pilzartige Kultur und floralen Zubereitungen), David Jones (floral Vorbereitungen und Extraktionen), Langley Oudemans (floral Vorbereitungen, Dreharbeiten/Fotografie), Jesse Lynch (floral Präparate), Roxanne Tumnalis (allgemeine Unterstützung) und zahlreiche Schüler/Ferialpraktikanten.
Materials
| 0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter | VWR | 101102-280 | Blueberry floral extract (FE) clarification |
| 200-1000 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
| 40-200 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
| 5-40 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
| Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter | Harbor Freight | 97098 | Blueberry rainwater (rw-)FE collection |
| Autoclave | Amsco | 3011 | Equipment, media preparation |
| Bar mesh matting (plastic mesh sheet) | Winco | BL-240 | Passive (pass)-FE collection |
| Benchtop timer | Fisher Scientific | 06-662-47 | Equipment, FE preparation |
| Black pressure/vacuum hose | VWR | 62994-795 | Vacuum filter component |
| Buchner funnel | Coors USA | 60240 | Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks |
| Bunsen burner | – | – | Equipment |
| Calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Media component |
| Centrifuge | Sorvall | RC 5B Plus | Equipment |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Fisher Scientific | 05-527-90 | Equipment |
| Centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 10025-694 | Equipment, rw-FE collection |
| Cheesecloth (grade 50) | Fisher Scientific | AS240 | Equipment, FE preparation |
| Chloroform | VWR | JT9175-3 | Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free |
| Corn Meal Agar (CMA) | Fisher Scientific | B11132 | Pre-mix media, isolate storage on slants |
| Cotton-blue stain | Sigma-Aldrich | 61335 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Curved forceps (45˚) | Fisher Scientific | 10-270 | Equipment, flower processing and coverslip inversion |
| Difco Agar | VWR | 90004-032 | Media component |
| Drill-press | Delta | – | Equipment, rw-FE collection |
| EASYpure LF Ultrapure water | Barnstead | D738 | Equipment, deionized water source |
| Ethanol (95%) | – | – | Chemical |
| Filter flask (500 ml) | Pyrex | No. 5340 | Vacuum filter component |
| Freezer (set to -20˚ C) | – | – | Equipment, storage of active-FE, pass-FE, rw-FE |
| Fume hood | Hamilton | – | Equipment, chloroform usage |
| Funnel (7 X 7 cm) | VWR | 60820-110 | Cranberry rw-FE collection, FE preparation |
| Generic glass slide | Fisher Scientific | 22-038-101 | Bioassay conductance |
| Generic plastic pump spray bottle | VWR | 16126-454 | pass-FE collection, at least 250 ml capacity |
| Glass cell culture tubes | – | – | Storage of ch-FE |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | Bioassay conductance |
| Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes) | – | – | Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID) |
| Glass-pipette (1-100 µl) | Hamilton Co. Inc. | #710 | ch-FE bioassay |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Hemocytometer | Bright-Line | 5971R10 | Equipment |
| Incubator (set to 25˚ C, dark) | Percival | 50036 | Equipment, bioassay conductance |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | W261106 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Laminar flow hood | Labconco | 3730400 | Equipment, sterile work environment |
| Metal probe (generic) | – | – | Equipment |
| Microcentrifuge tubes (2 ml) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Aqueous treatment mixture storage and preparation |
| Microscope, Leica DMLB | Leica | 020-519.010 | Equipment |
| Mortar (ceramic) | Coors USA | 60313 | Vacuum filter component |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | Flower collection |
| Paper disks (cut paper towels) | Office Basics | KCC01510 | humidity control in bioassay |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Plastic paraffin film |
| Pestle (ceramic) | Coors USA | 60314 | Vacuum filter component |
| Phenol crystals | Fisher Scientific | A92-100 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Plastic bags (~100 mm X 152 mm) | Uline | S1294 | Equipment, flower refrigeration |
| Plastic cell culture dishes (9 cm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | (Petri dish), bioassay conductance |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps | VWR | 60927-228 | Storage of ch-FE |
| Pyrex beakers (100 ml) | Pyrex | No. 1000 | Preparation of ch-FE |
| Pyrex bread-pan | – | – | pass-FE collection |
| Pyrex graduated cylinder | – | – | Equipment, FE preparation |
| Refrigerator (set to 4˚ C) | – | – | Equipment, storage of ch-FE |
| Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm) | – | – | Bioassay conductance |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | 8940 | Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks |
| Stainless steel mesh strainer | VWR | 470149-756 | Preparation of ch-FE |
| Step drill bit (step-bit) | Dewalt | – | Equipment, rw-FE collection |
| Sterile loop (combi-loop) | Fisher Scientific | 22-363-602 | Culture preparation |
| Telephone wire (internal wires) | – | – | Blueberry rw-FE collection |
| Test tube basket | VWR | 470137-792 | Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket |
| V8 Juice | Campbell's Soup Company | – | Fungal media component |
| Vintage plastic mesh [strawberry] baskets | Donation | – | pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792) |
| Vortex Genie (Vortex) | Fisher Scientific | 12-812 | Spore suspension preparation |
| Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles | Whatman | 1001-055 | Vacuum filter component |
| White plastic twist ties (100 mm) | Uline | S-566W | Cranberry rw-FE collection |
References
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