うり fioriniae水やクロロホルム ベースのブルーベリーとクランベリーの花エキスの開発

1. 菌、胞子懸濁液 自然感染したホスト19からうり fioriniaeを隔離します。その後、コーンミール寒天 (CMA) 傾斜のきれいな文化を保存します。V8 ジュース寒天培地 (cV8A) を (ミラー 1955 年から変更)、または非明らかに V8 ジュース寒天培地 (V8A)20いずれか明らかに標準的なプラスチック電池文化皿 (直径 9 cm) 含むに (CMA 傾斜) から文化のプラグを配置します。植民地は、感受性を開始するとき別の cV8A または V8A 分生子 (オレンジ色の胞子の固まり) を連勝高密度基部文化を生成する (標準的な滅菌ループ) と細胞培養皿を含んでいます。注: 菌類のプロトコル手順は fungal 文化や生物検定の汚染の可能性を減らすために層流フードで行わなければなりません。 後標準的な滅菌ループを使用して、成長の 7 日間 (胞子の固まりにループを軽く触れる) によって高密度培養から少量の分生胞子を収集、無菌純水 (SDW) 10 ml、15 mL 遠心管にこれをかき混ぜます。渦このサンプル 10 の s、し、標準のピペットを使用して突入、上下何度もさらにミックスするサンプル。 Vortexed サンプル、検定に一滴を配置し、胞子濃度を推定します。検定のカウント 5-10 フィールド平均を取得し、適切な希釈係数 (すなわち10,000)、平均で乗算 mL SDW あたり胞子濃度を得ること。 体積 (V) を使用して/濃度 (C) 式 (V1● [C1] = V2● [C2]) 5 mL 最終巻で SDW の mL あたり 10 の5分生胞子 X 1.0 (SDW) で調整します。これは胞子懸濁液と呼ばれます、いずれかの生物検定で使用する前にすぐに行われます。 2 花抽出の水ベース、アクティブ(アクティブ-FE)15,16 。 注: は、補足図 1、補足図 2、補足図 3、および補足ムービー 1を参照してください。 慎重に手収集ブルーベリー (4 月-5 月) とフィールド (補足図 1) で彼らのそれぞれのピークの花の中にクランベリー (6 月-7 月) 花です。着用し、人間の皮膚の油汚染を抑制するだけでなく、花の品種間のクロスコンタミネーション サンプリング場所 (品種/品種/物理的な場所) との間のニトリル手袋を変更します。(100 × 150 mm バッグを記入) ビニール袋に (単一のソース) からブルーベリーやクランベリーの花を配置し、花が収集される 4 ° C ですぐに冷蔵庫で冷やします。注:アクティブな抽出はレアンドロらから変更されます。(2003 年)16。 抽出前に任意の劣化、破損、病気にかかった花を削除し、健康な花を使用してカーブタイプ鉗子 (45 ピンセット) と卵巣、萼片と花柄を削除し、破棄します。アクティブな抽出に残りの器官の (カローラ、汚名、スタイル、雄しべ) を使用します。寒冷紗 (150 x 150 mm) をカット、7 x 7 mm 漏斗内に配置、クリーン 50 mL の遠心管に配置しておきます。 1 を組み合わせる部分処理 9 パーツ SDW 花 (1 wt: 9 巻比) モルタル。軽く 30 乳棒で粉をひく s (世話をサンプルを完全に粉砕する)。準備寒冷紗/目標到達プロセスを通じて生成されたパルプをひずみし、遠心分離機管 (50 mL) で収集します。きれいか各 95% エタノール抽出と暖かい流水の間新しい乳鉢/乳棒を使用します。 吸引ろ過の装置を準備: Buchner 漏斗、真空フィルター三角フラスコ (容量最大 1,000 mL)、55 ミリメートル円フィルター ペーパーおよび真空ホース/ソースを収集します。適切な大きさで分類されたブフナーにろ紙を追加し、フラスコの上に配置し、水に装置を接続/真空ホースを介してソースを吸引しておきます。 8,055 x gで 10 分間の遠心分離でブルーベリーの花の抽出物をさらに明確します。上澄みを離れて注ぎ、準備された真空ろ過装置、真空源オン、培養上清をフィルター処理し、新しい遠心管 (50 mL) 注ぎ、フラスコの内容。95% エタノールで各濾過精度と暖かい流水の間すべての装置コンポーネントをクリーンアップします。注射器をさらにフィルターは、0.22 μ m 孔径の殺菌、アセテート フィルター新しい遠心管 (50 mL) に適応。 クランベリーの花エキスのための真空だけはフィルター ペーパーを通してフィルター、新しい遠心管 (50 mL) にフラスコの内容を注ぐ。 結果として得られる準備をアクティブ- 花エキス (アクティブ -FE) と呼びます。-20 ° c 5-50 ml で実験的に使用されるまですべて水性花エキス (アクティブ、パッシブ雨水のコレクション) を格納します。複製を提供するために複数のサンプル (サンプルの種類ごとに少なくとも 3 抽出) の抽出を繰り返します。 3 花抽出の水ベース、パッシブ(渡す-FE) 16 。 注: は、補足的なムービー 2を参照してください。 収集全体ブルーベリーの花 (50 g)、上記のように手、収集した後冷蔵庫で冷やします。抽出、前に任意の劣化、破損、病気の花、そのまま花から花柄だけを取り外します。後述する受動的で抽出システムは、場所まで作製した試料を冷やしなさい。 95% エタノール (エタノール) と暖かい流水 (プラスチック製のメッシュ シート、2 つのプラスチック製のメッシュ バスケット、ガラスのパンのパン、ポンプ霧ボトル) の汚染を防ぐために使用する前のすべてのコンポーネントをすすいでください。また各上記の手順で 2.2、抽出、脇の 4 層寒冷紗/漏斗/50 mL 遠心管を準備します。 ふるいの準備: 1 つのプラスチック製のメッシュ バスケット (114 x 102 mm) に (別名バーのつや消しクリア) プラスチック製のメッシュ シートを配置。第二に、同じメッシュのバスケットを逆さま置き (SDW に座って花を避けるため) にガラスのパン-パン (127 x 229 mm) および場所に (反転) メッシュ シートの上にバスケットを含む。ふるいに準備された花の 50 グラムを追加します。注: また、[クレンジング] 小さな試験管バスケット使用できます (古い、緑、イチゴのメッシュのパイントのバスケットは、ソースが困難) もともと使用されていたプラスチック メッシュ バスケットの代わりに。 均等に 250 ml のポンプを使用して霧花霧ボトル、ガラスのパン-パンの流出をキャプチャします。その後、きれいな遠心管に準備寒冷紗/漏斗を通して濾液を株します。結果として得られる準備をパッシブ- 花エキス (パス -FE); と呼びます上記の (ステップ 2.6) あたりとして格納します。 各 95% エタノール抽出と暖かい流水の間のすべてのコンポーネントをクリーンアップします。複製 (少なくともサンプルの種類ごとの 3) を提供するために複数のサンプルの抽出を繰り返します。 4. クロロホルム ベース花エキス (ch FE) 17 (ステップ 2.1) の上あたりとブルーベリーとクランベリーの花を収集し、抽出 (手順 2.2、寒冷紗/漏斗準備なし) の花を準備します。使用前まで冷蔵の花を準備してください。 クロロホルムで実行任意の作業は、ヒューム フード安全理由のために実行する必要があります。これは材料の準備が含まれています/ガラス、抽出手順とバイオアッセイ コンダクタンス (ch FE を使用して手順)。 95% ですべてのコンポーネントをきれい江藤 2 回、そして二度それぞれの抽出の汚染を防ぐためにクロロホルム: ガラスの培養管、2 ガラス ビーカー、小さなステンレス画面、および [ガラス] 大学院シリンダーをスレッドします。乾燥逆さまに置いておきます。95 で 2 回並んでポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) キャップをリンス %etoh のみ (クロロホルムはキャップの外側の材料を損傷することは) 乾燥しておきます。 1 を組み合わせる部分処理 9 パーツ クロロホルムに花 (1 wt: 9 巻比) ビーカーに (花、クロロホルム)、軽く 30 s、および 2 つ目のビーカーにステンレス スクリーンを通して歪みの旋回。ガラス培養管 (10-15 mL) 注ぎ、2 つ目のビーカーから ch 鉄とテフロン キャップを貼る。パラフィルム蒸発を防ぐためにキャップをラップします。 これで準備はクロロホルム ベースの花エキス (ch FE) です。4 ° C で (光劣化を抑える) 暗闇の中で実験的に使用されるまでサンプルを格納します。複製 (少なくともサンプルの種類ごとの 3) を提供するために複数のサンプルの抽出を繰り返します。 5。 ブルーベリーの花 (BB rw-FE)16からの雨水のコレクション 注: ブルーベリー花雨水収集装置で構成されます接続アダプターと空気スプレーガン使い捨て塗料スプレー カップ (カップ: メネジ、アダプター: 男性へスレッド)、50 mL 遠沈管 (ポリプロピレン)、パラフィルム、およびプラスチック被覆電線 (標準の電話線、個々 の内部のワイヤー繊維の内容)。 雨水収集装置を作成する前に花の逃げるブルーベリー ブッシュ内の複数の場所を選択します。直下のブッシュ (クラウン) の非常に基本に花序 (花) が含まれます。レコード選択した地点に、この (1-5 cm に至る) 茎径は、下記のデバイス接続用の穴のサイズによって決定されます。 選択した箇所の回収装置を作成します。まずステップ ビットのドリル出版物に接続されている対応する幹直径 (どこへスレッド オープニング カップのカーブ) スプレー カップの下部に穴を開けます。その後、胴体の上部からスプレー カップの口の直線をカットします。スプレー カップの口で (大きさスレッド プラスチック被覆電線)、4 の等距離にある穴をドリルし、無料 1 つの端を残してプラスチック被覆ワイヤの一方の端を接続します。 50 mL 遠心分離機キャップ蓋に塗料噴霧器カップ アダプターをスレッド化するのに十分な大きさの穴を開けます。シールの漏れを防ぐためにパラフィルムのアダプター スレッド。遠心分離機キャップと噴霧器カップのねじ部の両方にこのファイルを添付します。嵌合 50 mL 遠心管を接続します。 選択した場所、サンプリング場所ごとに 4 つのコレクション デバイスの最小値に従って複数のデバイスを作成する手順 5.3 5.4. 茎に収まるように噴霧器カップを屈曲して選択した場所でデバイスを展開します。上向き (花の上を通過する水は、キャプチャを保証するため) に他の茎に付すプラスチック被覆ワイヤーを使用してスプレー カップのカット側に合わせます。パラフィルム雨水をリーク可能性があります任意の開口部に貼付します。(補足図 3図 4 の補足、補足図 5、および補足図 6)。 ラベル コレクション管配置と日付/時刻します。雨のイベント後削除し、遠心管の底 (チューブ) 部分を置き換える (日付をラベル/コレクションの時間)。内部流出コレクション (ブルーベリー雨水花エキス (BB rw-FE) と呼ばれる) を持参し、真空フィルター (ろ過ステップ 2.4 〜 2.5 で説明されている)。上記の (ステップ 2.6) として店水ベースの生物検定で使用されるまで。 6. クランベリーの花 (CB rw-FE) からの雨水のコレクション 7 × 7 cm ポリプロピレン漏斗、50 mL 遠沈管 (ポリプロピレン)、パラフィルム、クランベリーの花雨水回収装置から成り、4 標準、プラスチック被覆結束バンド (接続デバイス数)。 最初に、熱は、金属プローブを用いた漏斗の口の周り 8 等距離にある穴 (結束バンドの直径) を穿刺します。4 つの穴に結束バンドを挿入します。その穴の反対の場所にきちんとした交差パターンを形成する他の端部を取り付けます。パラフィルムで目標到達プロセス ダウン幹をラップしておきます。 ステップ ビット 50 mL 遠心分離機キャップに漏斗を茎を挿入するのに十分な大きさの穴を開けます。遠心分離機キャップに準備された漏斗を挿入します。手順 6.2 6.3 サンプリング場所ごとに 4 つのコレクション デバイスの最小値、複数のデバイスを作成するを繰り返します。 選択したクランベリー沼地にラベル (日付/時刻) デバイスを展開します。ちゃんと 2 つ花軸受花序 (アップライトとして知られている) 交差させたプラスチックねじれタイの下を挟みます。クランベリーのキャノピー (補足図 7-8、補足の映画 3) に遠心分離機管の穿孔によってデバイスを垂直方向に配置して。 降雨やオーバーヘッド灌漑後を削除し、遠心管の底 (チューブ) 部分を置き換える (日付をラベル/コレクションの時間)。内部流出 (クランベリー雨水花エキス (CB rw-FE) と呼ばれる) を持参し、真空フィルター (ろ過ステップ 2.4 〜 2.5 で説明されている)。上記の (ステップ 2.6) として店水ベースの生物検定で使用されるまで。 7. バイオアッセイ水ベース花エキス15,16 (アクティブ-渡す鉄-鉄、rw FE) 注: は、図 1を参照してください。 この検定は、層流フードで準備されます。材料の準備: トリプル リンス ガラス coverslips 95% エタノールと空気乾燥、その後、脇に置きます。紙タオル ディスクを標準のプラスチック製細胞培養皿 (9 cm) の内部の直径にカットします。培養皿の中でペーパー ディスクの 2 層を配置し、2 ml の SDW を浸します。 脇5分生子 SDW 胞子懸濁液 (C. fioriniae) あたりとして (手順 1.2-1.4)、上記の mL あたり 1.0 × 10 の少なくとも 5 mL を準備します。次に、マイクロ遠心チューブ用 SDW と 2 mL の花のエキスを水ベースの平等なボリュームをミックスします。胞子懸濁液の等量を (SDW プラス FE); 準備 2 mL 遠心チューブに追加します結果として得られる準備を水溶液処理混合物と呼びます。コントロールの鉄の部分を省略し、SDW 胞子濃度の一貫性を維持するに置き換えます。注: 部分のサイズはレプリケーションとタイム ポイントの数によって異なります。通常、部分は 500 μ L を超えないようにします。分生胞子と鉄を結合生物検定が始まりました、0 h 後接種。 細胞培養ディッシュに浸したペーパー タオルの上にあらかじめ洗浄し、ガラス coverslips を置きます。40 μ L 水溶液処理混合物の液滴を coverslip の中央に配置します。コントロールを含む目的の治療を繰り返し、細胞培養ディッシュを閉じます。レプリケーション (少なくとも 3) および時間ポイント (各料理は 1 時点) の別の細胞培養皿で繰り返します。すべてのトリートメントや複製をミックスすると、一度密閉プラスチック容器 (30 × 13 × 7 mm) にすべてレプリケートされた細胞培養皿を配置し、, 暗闇の中 25 ° C で。 所定の時点で成長を停止、液滴に葉身綿ブルー (20.0 g フェノール結晶、20.0 mL 2.5% 乳酸、40.0 mL グリセリン、0.05 g 綿ブルー) のような固定液の 10 μ L を追加し、半保存マウント。 これによりガラス表面に胞子の付着が、胞子の発芽に十分な長さではない、0 h 時間ポイントを収集するために 2 時間を待ちます。他のすべての時間ポイントでは、対応する時に定着剤を追加します。 定着剤を追加すると、慎重に顕微鏡検査 (スライドあたり 1 coverslip) を容易にするガラス顕微鏡スライド上を液滴側に配置する、coverslips を反転します。すべて coverslips ガラス顕微鏡スライド上にある、それらを解決する置いたまま 20 分間流フードで部分的に乾燥しています。 すべて分生子 (合計分生子) をいずれかの 400 倍の倍率 (16 フィールド カウント) を (4 つのフィールドをカウント) X 200 付着器だけでなく、(プライマリ分生子、発芽胞子と新しく形成された二次分生子) coverslip の提示数合計 3.808 ミリメートルのエリア2。 統計分析全体バイオアッセイをレプリケートします。水ベースの FE を使用して試金の分析データ ウォーラーらで説明されているよう201716、通常平均カウント/mm2 (合計分生胞子または付着器) を表示します。 8. バイオアッセイ クロロホルム ベース花エキス (ch FE)17 注: は、図 2を参照してください。 材料を準備し、上記の (手順 7.1) あたりとして培養皿の細胞します。さらに、ヒューム フード内ガラス ピペット (1 μ l 単位で 1 mL) と同様、coverslips、ヴァンの黒かび病菌細胞 (バント。 細胞) の数と同じ数 (8 mm 外径 6 mm 内径) リンス (95% で 2 回エタノール、クロロホルムで二回)、脇。 層流フードの 2 mL 遠心チューブを使用して 2 つの等しいボリューム (少なくとも 500 μ L 部分) の SDW と胞子懸濁液の 1 ボリュームを追加、脇します。これは ch FE 生物検定のため水溶液処理混合物です。 発煙のフード、バントを配置します。準備されたプラスチック製細胞培養ディッシュ内のガラス基板上にセルです。調剤 (ガラス製ピペット) 33 μ L 必要な ch FE のバン t. セルの中心に (、バントの壁を触れないでください。セル;コントロール治療のため追加処女クロロホルム)、乾燥できるようにと。レプリケーション (少なくとも 3) の別の細胞培養皿で繰り返します。 Ch FE が乾燥したら、99 μ L 標準ピペットと準備された水溶液処理の混合物のバントの中心に分配します。セル、し、閉じるすべては細胞培養皿です。水溶液処理混合物は、乾燥した ch FE 治療接触していますが、一度生物検定が始まりました、0 h 後接種。 すべてのトリートメントや複製をミックスすると、一度密閉プラスチック容器 (30 × 13 × 7 mm) にすべての (閉じた) 細胞培養皿を配置し、, 暗闇の中 25 ° C で。 あらかじめ決められた時点で、バントに定着剤 (葉身綿ブルー) の 15 μ L を追加します。セルと十分な真菌染色を保証するために、少なくとも 5 分の座らせて。その時間の後、バントを慎重に取り外します。携帯し、(ステップ 7.5 7.6) の上 coverslip の逆転やデータ取得の手順に従います。データ分析、Gager 201517、通常観察 (3.808 mm2) に数えられる付着器に合計分生胞子の比である付着器形成、としてデータの表示で説明されている方法に従ってください。 9. クランベリー フェノロジー ベース抽出17 手は、クランベリーの花を収集 (6 月で 100 g)、未熟な果実 (2 回7 月と 8 月。200 g)、クランベリーの果実収穫を成熟し、(10 月; 200 g)、適切なサイズのビニール袋に、4 ° C でコレクションの直後に冷蔵庫で冷やします。(ステップ 2.1) 上記汚染予防策を使用します。注: 各時に収集される余分な植物材料があるでしょうが、これらの金額は明らかに真菌感染した卵巣とフルーツ (症状や病気の兆候を示す) の抽出を防ぐ。 抽出、前に任意の劣化、破損、病気にかかった花を削除し、のみ健全な花を使用して、カーブタイプ鉗子 (45 ° ピンセット) と萼片、花柄、カローラ、柱頭、スタイルと雄しべを削除卵巣以外のすべてを破棄します。卵巣が収集されると、実行の 1 クロロホルムを用いた抽出 wt: 9 巻比 (卵巣のみを使用しての手順、4.2 4.4 で詳述)。他のすべての抽出が完了するまで、サンプルを保存すなわちバイオアッセイ コンダクタンスまで。 フルーツ収集、クロロホルムを用いた抽出 (ステップ 4.2 4.4、花の代わりに収集された果実を使用して、実行が、フルーツの 10 g をクロロホルムの 90 mL に追加、一度抽出した、許可 (10 g: 9 mL wt の結果 9 mL を蒸発させるためのソリューション: 巻ソリューション)。 7 月、8 月、10 月を収集した後にすぐにフルーツ抽出を行います。上記の (手順 4.4) ごととしてストアをすべて抽出が収集されるまで。最後のクロロホルム ベース フルーツ抽出後クロロホルムに基づくバイオアッセイにこの試金のため収集したすべてのタギク ベースのクロロホルム抽出の対象し、それに応じて分析 (8.1 8.6 のステップ)。