Generation af kræft celle kloner til at visualisere Telomeric Repeat-holdige RNA TERRA udtrykt fra en enkelt Telomer i levende celler
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at generere kræft celle kloner indeholdende en MS2 sekvens tag på en enkelt subtelomere. Denne tilgang, lid MS2-normal god landbrugspraksis system, giver mulighed for visualisering af de endogene afskrifter af telomeric repeat-holdige RNA (TERRA) udtrykt fra en enkelt Telomer i levende celler.
Abstract
Telomerer er transskriberet, giver anledning til telomeric repeat-holdige længe noncoding RNA’er (TERRA), som er blevet foreslået til at spille en vigtig rolle i telomere biologi, herunder heterochromatin dannelse og telomere længde homøostase. De seneste resultater viste, at TERRA molekyler også interagere med interne kromosomale områder at regulere genekspression i mus embryonale stamceller (ES) celler. I overensstemmelse med denne dokumentation, RNA fluorescens i situ hybridisering (RNA-fisk) analyser har vist, at kun et undersæt af TERRA udskrifter lokalisere på kromosom ender. En bedre forståelse af dynamikken i TERRA molekyler vil hjælpe med at definere deres funktion og virkningsmekanismer. Her, beskriver vi en metode til at mærke og visualisere single-telomere TERRA udskrifter i kræftceller ved hjælp MS2-normal god landbrugspraksis system. Til dette formål præsenterer vi en protokol til at generere stabile kloner, ved hjælp af AGS menneskelige mave cancer cellelinie, indeholder MS2 sekvenser integreret på en enkelt subtelomere. Transskription af TERRA fra MS2-tagged telomere resulterer i udtryk for MS2-tagged TERRA molekyler, der er visualiseret ved live-celle Fluorescens mikroskopi efter Co udtryk for en MS2 RNA-bindende protein smeltet til normal god landbrugspraksis (MS2-NGL). Denne tilgang gør det muligt for forskere at studere dynamikken i single-telomere TERRA molekyler i kræftceller, og det kan anvendes til andre cellelinjer.
Introduction
Den lange noncoding RNA TERRA er transskriberet fra regionen subtelomeric i kromosomer og dens transskription provenuet mod kromosom enderne, terminering i telomeric gentage tarmkanalen1,2. Af denne grund, TERRA udskrifter består af subtelomeric-afledte sekvenser på deres 5′ ende og opsige med telomeric gentagelser (UUAGGG i hvirveldyr)3. Vigtige roller er blevet foreslået for TERRA, herunder heterochromatin dannelse på telomerer4,5, DNA replikation6, fremme homologe rekombination blandt kromosom slutter7,8 , 9, regulering af telomere struktur10og telomere længde homøostase2,11,12,13. Derudover interagere TERRA udskrifter med talrige extratelomeric websteder til at regulere udbredt genekspression i mus embryonale stamceller (ES) celler14. I overensstemmelse med disse beviser, RNA fluorescens i situ hybridisering (RNA-fisk) analyser har vist, at kun et undersæt af TERRA udskrifter lokalisere på telomerer1,2,15. Derudover er TERRA blevet rapporteret at form nukleare aggregater lokalisering på X- og Y-kromosomer i mus celler2,16. Disse resultater viser, at TERRA udskrifter gennemgå kompleks dynamik i kernen. Forståelse af dynamikken i TERRA molekyler vil hjælpe med at definere deres funktion og virkningsmekanismer.
MS2-normal god landbrugspraksis system har været meget anvendt til at visualisere RNA molekyler i levende celler fra forskellige organismer17,18. Dette system har tidligere været anvendt til tag og visualisere single-telomere TERRA molekyler i S. cerevisiae12,19. Ved hjælp af dette system, blev det for nylig vist, gær TERRA udskrifter lokalisere i cytoplasma i post-diauxic Skift fase, tyder på, at TERRA kan udøve extranuclear funktioner20. Vi har for nylig brugt MS2-normal god landbrugspraksis systemet for at studere single-telomere TERRA udskrifter i kræft celler21. Til dette formål, vi ansat CRISPR/Cas9 genom redaktion værktøj at integrere MS2 sekvenser på en enkelt telomere (telomere 15q, i det følgende benævnt Tel15q) og opnået kloner udtrykker MS2-tagged endogene Tel15q TERRA (TERRA-MS2 kloner). Co udtryk for en normal god landbrugspraksis-smeltet MS2 RNA-bindende protein (MS2-NGL), genkender og binder MS2 RNA sekvenser giver mulighed for visualisering af single-telomere TERRA udskrifter i levende celler,21. Formålet med protokollen illustreret her er at beskrive i detaljer de trin, der kræves for generation af TERRA-MS2 kloner.
For at generere TERRA-MS2 kloner, en MS2 kassette er integreret inden for regionen subtelomeric af telomere 15q, neden for TERRA promotor-regionen og transskription startsted. MS2 kassette indeholder et neomycin resistens gen flankeret af lox-p steder, og dets integration ved subtelomere 15q udføres ved hjælp af CRISPR/Cas9 system22. Efter Transfektion af MS2 kassette, enkelt kloner er valgt og subtelomeric integration af kassetten bekræftes ved PCR, duppes DNA sekvensering og sydlige. Positive kloner er inficeret med en Cre-udtrykker adenovirus for at fjerne markeringen markør i kassette, forlader kun MS2 sekvenser og en enkelt lox-p websted på subtelomere 15q. Udtryk for MS2-tagged TERRA udskrifter fra Tel15q er verificeret af RT-qPCR. Endelig, MS2-normal god landbrugspraksis fusion protein er udtrykt i TERRA-MS2 kloner via retroviral infektion for at visualisere MS2-TERRA udskrifter af Fluorescens mikroskopi. TERRA udskrifter kan let påvises af RNA-fisk og live-celle imaging ved hjælp af telomeric repeat-specifikke sonder1,2,15,23. Disse tilgange giver vigtige oplysninger om lokalisering af den samlede befolkning i TERRA molekyler med enkelt celle opløsning. Generation af kloner indeholdende MS2 sekvenser på en enkelt subtelomere vil sætte forskerne i at studere dynamikken i single-telomere TERRA udskrifter i levende celler, som vil hjælpe med at definere funktion og virkningsmekanismer af TERRA.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikel præsenterer vi en metode til at generere menneskelige kræft celle kloner indeholdende MS2 sekvenser integreret inden for subtelomere 15q. Brug disse kloner, registreres MS2-tagged TERRA molekyler transskriberet fra subtelomere 15q af Fluorescens mikroskopi af co udtryk for en normal god landbrugspraksis MS2 fusion protein. Denne tilgang gør det muligt for forskere at studere dynamikken i TERRA udtrykt fra en enkelt Telomer i levende celler,21. I denne protokol, er TERRA-MS2 klon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for ansatte i den avancerede billedbehandling anlæg i CIBIO på universitetet i Trento og BioOptics lys mikroskopi facilitet på Max F. Perutz laboratorier (MFPL) i Wien. Forskning fører til disse resultater har modtaget støtte fra Mahlke-Obermann Stiftung og EUs syvende rammeprogram for forskning, teknologisk udvikling og demonstration under tilskudsaftalen ingen 609431 til EF. EF er understøttet af en Rita Levi Montalcini stipendium fra det italienske ministerium for uddannelse University og forskning (MIUR).
Materials
| AGS cells | – | – | Gift from Christian Baron (Université de Montréal). |
| F12K Nut Mix 1X | GIBCO | 21127022 | Culturing medium for AGS cells |
| L-Glutamine | CORNING | MT25005CI | Component of cell culturing medium |
| Penicillin Streptomycin Solution | CORNING | 30-002-CI | Component of cell culturing medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | Component of cell culturing medium |
| DMEM 1X | GIBCO | 21068028 | culturing medium for phoenix cell |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | used in phoenix cell transfection |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X | CORNING | 59430C | used in cell split |
| DPBS 1X | GIBCO | 14190250 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO) |
| G-418 Disulphate | Formedium | G4185 | selection drug for |
| Gelatin solution Bioreagent | Sigma Aldrich | G1393 | cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate |
| Tris-base | Fisher BioReagents | 10376743 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| SDS | Sigma Aldrich | 71729 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| Proteinase K | Thermo Fisher | AM2546 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| RNAse A | Thermo Fisher | 12091021 | RNA degradation during DNA extraction |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | DNA gel preparation |
| Atlas ClearSight | Bioatlas | BH40501 | Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel |
| ethanol | Fisher BioReagents | BP28184 | DNA precipitation |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 71196 | Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2 |
| Wizard SV Gel and PCR clean-Up system | Promega | A9282 | Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones |
| Trizol | AMBION | 15596018 | Organic solvent used for RNA extraction |
| Dnase I | THERMO SCIENTIFIC | 89836 | degradation of genomic DNA from RNA |
| dNTPs mix | Invitrogen | 10297018 | used in RT and PCR reactions |
| DTT | Invitrogen | 707265ML | used in RT reactions |
| diethyl pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution) |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| MOPS | Sigma Aldrich | M9381 | preparation of RNA gel |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS) |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | Retrotranscription reaction |
| Pfu DNA polymerase (recombinant) | Thermo Scientific | EP0501 | PCR reaction |
| 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX | PCR BIOSYSTEMS | PB 20.14 | qPCR reaction |
| Cre-GFP adenovirus | https://medicine.uiowa.edu/vectorcore | 1174-HT | used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | used to promote retrovirus particles production in phoenix cells |
| PEG8000 | Sigma Aldrich | 89510 | Precipitation of retrovirus partcles |
| 35µ-Dish Glass Bottom | Ibidi | 81158 | used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones |
References
- Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
- Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
- Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
- Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
- Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).
- Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).
- Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220 (2014).
- Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
- Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
- Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
- Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
- Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).
- Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
- Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
- Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
- Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
- Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
- Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
- Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
- Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910 (2016).
- Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
- Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
- Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
- Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379 (2014).
- Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).
- Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
- Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
- Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).
