Geração de Clones de células câncer Visualizar oligospermia Repeat-contendo RNA TERRA expressado de um único dos telômeros em células vivas
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para gerar clones de células de câncer que contém uma marca de sequência MS2 em um único subtelomere. Esta abordagem, baseando-se no sistema MS2-GFP, permite a visualização de transcrições endógenas de oligospermia repetição contendo RNA (TERRA) expressado de um único dos telômeros em células vivas.
Abstract
Telômeros são transcritas, dando origem a oligospermia repetição-contendo o tempo não-codificante RNAs (TERRA), que têm sido propostos para desempenhar um papel importante na biologia do telômero, incluindo formação de heterocromatina e homeostase do comprimento dos telômeros. Descobertas recentes revelaram que as moléculas TERRA também interagirem com regiões cromossômicas internas para regular a expressão gênica em células-tronco embrionárias (ES) do mouse. Em consonância com esta evidência, RNA fluorescência em situ hibridização RNA-análises mostraram que somente um subconjunto de TERRA transcrições localizar nas extremidades do cromossomo. Uma melhor compreensão da dinâmica das moléculas da TERRA ajudará a definir sua função e mecanismos de ação. Aqui, descrevemos um método para rotular e visualizar as transcrições TERRA single-telômero nas células cancerosas, usando o sistema MS2-GFP. Para este objetivo, apresentamos um protocolo para gerar clones estáveis, usando a linhagem de células de câncer de estômago humano AGS, contendo sequências MS2 integradas em um único subtelomere. Transcrição de TERRA do telômero MS2-tag resulta na expressão de moléculas TERRA MS2-marcados que são visualizados por microscopia de fluorescência de viver-pilha sobre co expressão de uma proteína RNA MS2-fundida a GFP (MS2-GFP). Esta abordagem permite aos pesquisadores estudar a dinâmica de moléculas TERRA single-telômero nas células cancerosas, e pode ser aplicado a outras linhas de célula.
Introduction
O tempo não-codificante TERRA de RNA é transcrito da região subtélomérique dos cromossomos e sua transcrição prossegue em direção as extremidades do cromossoma, encerra-se no âmbito do trato repetição oligospermia1,2. Por esta razão, transcrições TERRA consistem em sequências de derivados de subtelomeric na sua extremidade 5′ e encerrar com repetições teloméricas (UUAGGG em vertebrados)3. Importantes funções têm sido propostos para a TERRA, incluindo a formação de heterocromatina telômeros4,5, DNA replicação6, promovendo uma recombinação homóloga entre cromossomo termina7,8 , 9, regulamenta o telômero estrutura10e telômero comprimento homeostase2,11,12,13. Além disso, transcrições TERRA interagirem com inúmeros locais de extratelomeric para regular a expressão gênica generalizada em rato de células estaminais embrionárias (ES)14. Em consonância com estas provas, RNA fluorescência em situ da hibridação análises (RNA-FISH) têm demonstrado que somente um subconjunto de transcrições TERRA localizar ao telômeros1,2,15. Além disso, a TERRA tem sido relatado para agregados nucleares de forma localizando nos cromossomos X e Y em células de rato2,16. Estes resultados indicam que as transcrições TERRA sofrer uma dinâmica complexa dentro do núcleo. Compreensão da dinâmica das moléculas da TERRA ajudará a definir sua função e mecanismos de ação.
O sistema MS2-GFP tem sido amplamente utilizado para visualizar moléculas de RNA em células vivas de vários organismos17,18. Este sistema tem sido anteriormente usado para tag e Visualizar moléculas TERRA single-telômero em S. cerevisiae12,19. Usando este sistema, recentemente foi demonstrado que as transcrições TERRA de levedura localizar dentro do citoplasma durante a fase de mudança de post-diauxic, sugerindo que a TERRA pode exercer funções extranuclear20. Recentemente nós usamos o sistema MS2-GFP estudar transcrições TERRA single-telômero em células de câncer21. Para este objectivo, que empregou a ferramenta de edição de genoma CRISPR/Cas9 integrar MS2 sequências em um único telômero (telômero 15q, doravante Tel15q) e obtidos clones expressando MS2-tag endógena Tel15q TERRA (TERRA-MS2 clones). Co a expressão de uma proteína GFP-fundido MS2 RNA-obrigatórias (MS2-GFP) que reconhece e liga MS2 RNA sequências permite visualização de transcrições TERRA single-telômero na vida células21. O objetivo do protocolo ilustrado aqui é descrever em detalhe os passos necessários para a geração de clones de TERRA-MS2.
Para gerar TERRA-MS2 clones, uma gaveta MS2 é integrada dentro da região de subtélomérique do telômero 15q, a jusante do TERRA promotor região e transcrição iniciar site. A MS2 gaveta contém um gene de resistência de neomicina ladeado por sites de salmão fumado-p, e sua integração no subtelomere 15q é executada usando o sistema CRISPR/Cas922. Depois de Transfeccao de gaveta, única clona o MS2 são selecionados e subtélomérique integração da fita é verificada pelo PCR, DNA, sequenciamento e Southern blot. Clones positivos estão infectados com um vírus adenoide Cre-expressando a fim de remover o marcador de seleção na gaveta, deixando apenas as sequências MS2 e um site único lox-p no subtelomere 15q. Expressão de transcritos TERRA MS2-tag de Tel15q é verificada por RT-qPCR. Finalmente, a proteína de fusão MS2-GFP é expressa em TERRA-MS2 clones através de infecção retroviral para visualizar as transcrições MS2-TERRA por microscopia de fluorescência. Transcrições TERRA podem ser facilmente detectadas por RNA-peixe e imagem latente da viver-pilha usando específicas repetição oligospermia sondas1,2,15,23. Estas abordagens fornecem informações importantes sobre a localização da população total de moléculas TERRA em resolução de célula única. A geração de clones contendo MS2 sequências em um único subtelomere permitirá aos pesquisadores estudar a dinâmica de transcrições TERRA single-telômero em células vivas, o que ajudarão a definir a função e os mecanismos de ação da TERRA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, apresentamos um método para gerar clones de célula de câncer humano contendo sequências MS2 integradas dentro subtelomere 15q. Usando estes clones, as moléculas TERRA MS2-tag transcritas do subtelomere 15q são detectadas por microscopia de fluorescência pela expressão co de uma proteína de fusão MS2-GFP. Esta abordagem permite aos pesquisadores estudar a dinâmica da TERRA, expressado de um único dos telômeros em vida células21. Neste protocolo, TERRA-MS2 clones são sel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos ao pessoal da instalação de imagem avançada do CIBIO para a Universidade de Trento e a facilidade de microscopia de luz de BioOptics na F. Max Perutz laboratórios (MFPL) em Viena. A pesquisa que conduz a estes resultados tem recebeu financiamento da Stiftung Mahlke-Anderson e o sétimo programa-quadro da União Europeia para a investigação, desenvolvimento tecnológico e demonstração no âmbito do acordo de concessão não 609431 CE. CE é apoiado por uma bolsa de Rita Levi Montalcini do Ministério da Educação Universidade e pesquisa (MIUR) italiano.
Materials
| AGS cells | – | – | Gift from Christian Baron (Université de Montréal). |
| F12K Nut Mix 1X | GIBCO | 21127022 | Culturing medium for AGS cells |
| L-Glutamine | CORNING | MT25005CI | Component of cell culturing medium |
| Penicillin Streptomycin Solution | CORNING | 30-002-CI | Component of cell culturing medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | Component of cell culturing medium |
| DMEM 1X | GIBCO | 21068028 | culturing medium for phoenix cell |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | used in phoenix cell transfection |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X | CORNING | 59430C | used in cell split |
| DPBS 1X | GIBCO | 14190250 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO) |
| G-418 Disulphate | Formedium | G4185 | selection drug for |
| Gelatin solution Bioreagent | Sigma Aldrich | G1393 | cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate |
| Tris-base | Fisher BioReagents | 10376743 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| SDS | Sigma Aldrich | 71729 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| Proteinase K | Thermo Fisher | AM2546 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| RNAse A | Thermo Fisher | 12091021 | RNA degradation during DNA extraction |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | DNA gel preparation |
| Atlas ClearSight | Bioatlas | BH40501 | Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel |
| ethanol | Fisher BioReagents | BP28184 | DNA precipitation |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 71196 | Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2 |
| Wizard SV Gel and PCR clean-Up system | Promega | A9282 | Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones |
| Trizol | AMBION | 15596018 | Organic solvent used for RNA extraction |
| Dnase I | THERMO SCIENTIFIC | 89836 | degradation of genomic DNA from RNA |
| dNTPs mix | Invitrogen | 10297018 | used in RT and PCR reactions |
| DTT | Invitrogen | 707265ML | used in RT reactions |
| diethyl pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution) |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| MOPS | Sigma Aldrich | M9381 | preparation of RNA gel |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS) |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | Retrotranscription reaction |
| Pfu DNA polymerase (recombinant) | Thermo Scientific | EP0501 | PCR reaction |
| 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX | PCR BIOSYSTEMS | PB 20.14 | qPCR reaction |
| Cre-GFP adenovirus | https://medicine.uiowa.edu/vectorcore | 1174-HT | used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | used to promote retrovirus particles production in phoenix cells |
| PEG8000 | Sigma Aldrich | 89510 | Precipitation of retrovirus partcles |
| 35µ-Dish Glass Bottom | Ibidi | 81158 | used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones |
References
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