Поколение клоны клеток рака для визуализации Telomeric повтор содержащие РНК Терра выразил от одного теломер в живых клеток
Summary
Здесь мы представляем протокол для создания клоны клеток рака, содержащий MS2 последовательности тег в одной subtelomere. Этот подход, опираясь на системе MS2-GFP, позволяет визуализации эндогенного стенограммы из telomeric повтор содержащие РНК (Терра) выразил от одного теломер в живых клетках.
Abstract
Теломеры транскрибируется, рождая telomeric повтор содержащих длиной некодирующих РНК (Терра), которой было предложено играть важную роль в биологии теломер, включая формирование гетерохроматин и гомеостаза Длина теломер. Последние результаты показали, что молекулы Терра также взаимодействовать с внутренней хромосомных регионов для регулирования экспрессии генов в мышиных эмбриональных стволовых (ES) клеток. С учетом этих доказательств, РНК флуоресценции в situ гибридизация (РНК-рыбы) анализы показали, что только подмножество Терра стенограммы локализовать на концах хромосомы. Лучшего понимания динамики молекул Терра поможет определить их функции и механизмы действия. Здесь мы описываем метод ярлык и визуализировать сингл теломеры Терра стенограммы в раковых клетках, с использованием системы MS2-GFP. С этой целью мы представляем протокол для создания стабильной клоны, используя линии клеток рака человеческого желудка AGS, содержащий MS2 последовательности, интегрированных в один subtelomere. Транскрипция Терра с меткой MS2 теломер приводит выражение с тегами MS2 Терра молекул, которые визуализируются микроскопии флуоресцирования клеток после совместного выражение MS2 RNA-связывая протеинов, сливается с GFP (MS2-ГФП). Этот подход позволяет исследователям изучить динамику одного теломеры Терра молекул в раковых клетках, и он может быть применен к другим клеточных линий.
Introduction
Длиной некодирующих Терра РНК транскрибируется из региона subtelomeric хромосом и его транскрипции приступает к концам хромосомы, завершение в течение1,telomeric повторить тракта2. По этой причине Терра стенограммы состоят из subtelomeric производные последовательностей в конце их 5′ и прекратить с telomeric повторяется (UUAGGG позвоночных)3. Важные роли были предложены для TERRA, включая формирование гетерохроматин теломеры4,5, ДНК репликации6, поощрение гомологичная рекомбинация среди хромосома заканчивается7,8 , 9, регулирующих теломер структуры10и теломер длина гомеостаза2,11,12,13. Кроме того Терра стенограммы взаимодействуют с многочисленными extratelomeric сайтов для регулирования экспрессии генов широко в мыши эмбриональных стволовых (ES) клетки14. С учетом этих доказательств, флуоресценции в situ гибридизация РНК (РНК-рыбы) анализы показали что только подмножество Терра стенограммы локализовать теломеры1,2,15. Кроме того Терра сообщалось в форме ядерного агрегатов, локализация на X и Y хромосомы в мыши клетки2,16. Эти результаты показывают, что Терра стенограммы пройти сложную динамику в ядре. Понимание динамики молекул Терра поможет определить их функции и механизмы действия.
MS2-GFP системы широко используется для визуализации молекул РНК в живых клетках различных организмов17,18. Эта система использовалась ранее тег и визуализировать сингл теломеры Терра молекул в S. cerevisiae12,19. С помощью этой системы, недавно было показано, что дрожжи Терра стенограммы локализовать в цитоплазме во время пост diauxic сдвиг фазы, предполагая, что Терра могут оказывать extranuclear функций20. Недавно мы использовали MS2-GFP системы для изучения одного теломеры Терра стенограммы в раковых клетках21. С этой целью мы заняты средство редактирования генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9 для интеграции MS2 последовательности в одном теломер (теломеры 15q, далее Tel15q) и получены клоны, выражая MS2-тегами эндогенного Tel15q TERRA (Терра-MS2 клоны). Сопредседатель выражение GFP-кварцевое MS2 RNA-связывая белка (MS2-GFP), что признает и связывает MS2 РНК последовательности позволяет визуализации одного теломеры Терра стенограмм в живых клетках21. Цель Протокола, показанные здесь является подробно описать шаги, необходимые для создания клонов Терра-MS2.
Для создания клонов Терра-MS2, мс2 кассету интегрирован в регионе subtelomeric теломер 15q, ниже по течению Терра промоутер региона и транскрипции запуск сайта. Кассета MS2 содержит ген сопротивления неомицин, обрамленная аргона p сайты, и ее интеграции в subtelomere 15q осуществляется с помощью системы ТРИФОСФАТЫ/Cas922. После того, как выбираются трансфекции MS2 Кассетный сингл клоны и subtelomeric интеграции кассеты проверяется методом ПЦР, ДНК последовательности и Южные помарки. Позитивные клоны были заражены Cre выражая аденовирус, чтобы удалить маркер выделения в кассету, оставив только MS2 последовательности и один жидкий кислород p сайта на subtelomere 15q. Выражения с меткой MS2 Терра транскрипты от Tel15q проверяется по RT-ПЦР. И наконец, выражается MS2-GFP синтез белка в Терра-MS2 клоны через ретровирусной инфекции для того, чтобы визуализировать MS2-Терра стенограммы микроскопии флуоресцирования. Терра стенограммы могут быть легко обнаружены РНК-рыба и клеток изображений с использованием telomeric повтор конкретных зондов1,2,15,23. Эти подходы обеспечивают важную информацию о локализации всего населения Терра молекул в одну ячейку резолюции. Поколение клонов, содержащих MS2 последовательности в одном subtelomere позволит исследователей для изучения динамики сингл теломеры Терра стенограмм в живых клетках, которые помогут определить функции и механизмы действия Терра.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы представляем метод для создания человеческих раковых клеток клоны, содержащие MS2 последовательности в рамках subtelomere 15q. Используя эти клоны, мс2 тегами Терра молекул, трансляции из subtelomere 15q распознаются микроскопии флуоресцирования выражением совместного MS2-GFP синтез бе…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны сотрудникам передовой визуализации объекта CIBIO в университете Тренто и Фондом BioOptics свет микроскопия на Макс ф Perutz лабораторий (MFPL) в Вене. Исследований, приведших к эти результаты получил финансирование от Mahlke-Оберманн Stiftung и седьмой рамочной программы Европейского союза для исследований, технологических разработок и демонстрации соглашению Грант не 609431 в ЕС. EC поддерживается Рита Леви Монтальчини стипендий от итальянского министерства образования университета и исследования (MIUR).
Materials
| AGS cells | – | – | Gift from Christian Baron (Université de Montréal). |
| F12K Nut Mix 1X | GIBCO | 21127022 | Culturing medium for AGS cells |
| L-Glutamine | CORNING | MT25005CI | Component of cell culturing medium |
| Penicillin Streptomycin Solution | CORNING | 30-002-CI | Component of cell culturing medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | Component of cell culturing medium |
| DMEM 1X | GIBCO | 21068028 | culturing medium for phoenix cell |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | used in phoenix cell transfection |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X | CORNING | 59430C | used in cell split |
| DPBS 1X | GIBCO | 14190250 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO) |
| G-418 Disulphate | Formedium | G4185 | selection drug for |
| Gelatin solution Bioreagent | Sigma Aldrich | G1393 | cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate |
| Tris-base | Fisher BioReagents | 10376743 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| SDS | Sigma Aldrich | 71729 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| Proteinase K | Thermo Fisher | AM2546 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| RNAse A | Thermo Fisher | 12091021 | RNA degradation during DNA extraction |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | DNA gel preparation |
| Atlas ClearSight | Bioatlas | BH40501 | Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel |
| ethanol | Fisher BioReagents | BP28184 | DNA precipitation |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 71196 | Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2 |
| Wizard SV Gel and PCR clean-Up system | Promega | A9282 | Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones |
| Trizol | AMBION | 15596018 | Organic solvent used for RNA extraction |
| Dnase I | THERMO SCIENTIFIC | 89836 | degradation of genomic DNA from RNA |
| dNTPs mix | Invitrogen | 10297018 | used in RT and PCR reactions |
| DTT | Invitrogen | 707265ML | used in RT reactions |
| diethyl pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution) |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| MOPS | Sigma Aldrich | M9381 | preparation of RNA gel |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS) |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | Retrotranscription reaction |
| Pfu DNA polymerase (recombinant) | Thermo Scientific | EP0501 | PCR reaction |
| 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX | PCR BIOSYSTEMS | PB 20.14 | qPCR reaction |
| Cre-GFP adenovirus | https://medicine.uiowa.edu/vectorcore | 1174-HT | used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | used to promote retrovirus particles production in phoenix cells |
| PEG8000 | Sigma Aldrich | 89510 | Precipitation of retrovirus partcles |
| 35µ-Dish Glass Bottom | Ibidi | 81158 | used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones |
References
- Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
- Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
- Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
- Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
- Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).
- Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).
- Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220 (2014).
- Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
- Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
- Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
- Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
- Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).
- Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
- Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
- Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
- Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
- Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
- Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
- Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
- Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910 (2016).
- Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
- Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
- Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
- Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379 (2014).
- Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).
- Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
- Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
- Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).
