生きている細胞の単一テロメアから表現されるテロメア繰り返し含む RNA テラを視覚化するがん細胞クローンの生成

染色体の subtelomeric 領域から長鎖非コード RNA テラを転写し、その転写染色体はテロメアの繰り返し管^1,2内終了終了へ向かって。このため、テラの成績証明書は 5′ 端に subtelomeric の派生シーケンスから成り、テロメアの繰り返し (脊椎動物の UUAGGG)³で終了します。重要な役割は、テロメア^4,5, DNA 複製⁶、染色体の間での相同組換えの促進のヘテロクロマチン形成を含む終了する^7,8テラ、提案されています。^,9、テロメア構造¹⁰およびテロメアの長さの恒常性^2,11,12,13を規制します。さらに、テラの成績証明書は、マウス胚性幹 (ES) 細胞¹⁴における広範な遺伝子発現を調節する多数の extratelomeric サイトと対話します。これらに伴い、RNA 蛍光性の現場の交配 (RNA 魚) 解析はテラ成績のサブセットのみを示している証拠はテロメア^1,2,15ローカライズします。さらには、テラはマウス細胞^2,16の X および Y 染色体でローカライズする原子集合体を形成する報告されています。テラ成績が核内の複雑なダイナミクスを受けることが示唆されました。テラ分子のダイナミクスを理解し彼らの機能と作用機構を定義するのに役立ちます。

MS2 GFP システムは、広く様々 な生物^17,18から細胞内 RNA 分子を可視化するために使用されています。このシステムは、タグを出芽酵母^12,19のシングル テロメア テラ分子を可視化する以前使用されています。このシステムを使用すると、最近、酵母テラ成績証明書をポスト発酵から呼吸へシフト フェーズでローカライズ細胞質内テラ可能性がありますにおける核外機能²⁰を及ぼすことを示唆しているが示されました。最近がん細胞²¹シングル テロメア テラ トラン スクリプトを勉強する MS2 GFP システムを使いました。この目的には、MS2 単一テロメア (テロメア 15q、以下 Tel15q) でシーケンスを統合する CRISPR/Cas9 ゲノム編集ツールを採用し、MS2 タグ内因性 Tel15q テラ (テラ MS2 クローン) の表現のクローンを得た。認識し、生活で単一テロメア テラ成績の MS2 RNA シーケンスにより可視化を結合する GFP 融合 MS2 RNA 結合タンパク質 (MS2 GFP) の共発現細胞²¹です。ここに示されているプロトコルの目的は、テラ MS2 クローンの生成のために必要な手順の詳細に説明することです。

テロメア 15q、subtelomeric 地域で統合され、MS2 カセット テラ MS2 のクローンを生成するテラ プロモーター領域と転写開始部位の下流。MS2 カセットには lox p サイトに挟まれたネオマイシン耐性遺伝子が含まれています、subtelomere 15q での統合は、CRISPR/Cas9 システム²²を使用して実行されます。カセット、単一クローン MS2 のトランスフェクションが選択され PCR によってカセットの subtelomeric 統合が確認されたら、DNA 配列と南部のしみ。肯定的なクローンは、subtelomere 15q で単一 lox p サイト MS2 シーケンスだけを残して、カセットの選択マーカーを除去するために Cre を発現アデノ ウイルスに感染しています。RT qPCR により Tel15q からタグ付きの MS2 のテラの式を確認すると.最後に、MS2 GFP の融合蛋白質を表現に蛍光顕微鏡による MS2 テラ成績を視覚化するためにレトロ ウイルス感染テラ MS2 クローンで。RNA 魚でテラの成績証明書を容易に検出できるし、テロメア繰り返し固有を使用して生細胞イメージング プローブ^1,2,15,23。これらのアプローチは、単一セルの解像度でテラ分子の総人口の局在に関する重要な情報を提供します。単一 subtelomere で MS2 シーケンスを含んでいるクローンの生成には、関数とテラの作用のメカニズムを定義する生きた細胞の単一テロメア テラ転写物のダイナミクスを研究する研究者が有効になります。