جيل من سرطان الخلية استنساخ لتصور تيلوميريك التي تحتوي على تكرار الحمض النووي الريبي تيرا أعرب من Telomere واحدة في الخلايا الحية
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتولد السرطان استنساخ الخلية التي تحتوي على علامة تسلسل MS2 في سوبتيلوميري واحد. ويمكن هذا النهج، الاعتماد على نظام MS2-التجارة والنقل، والتصور النصوص الذاتية من تيلوميريك التي تحتوي على تكرار “الحمض النووي الريبي” (TERRA) أعرب من telomere واحدة في الخلايا الحية.
Abstract
التيلومير يتم نسخها، مما أدى إلى تيلوميريك المحتوية على تكرار الكشف فضله منذ فترة طويلة (TERRA)، التي اقترحت أن تلعب أدواراً هامة في علم الأحياء telomere، بما في ذلك تشكيل هيتيروتشروماتين والتوازن طول telomere. وأظهرت النتائج الأخيرة أن جزيئات تيرا تتفاعل أيضا مع المناطق الكروموسومات الداخلية لتنظيم التعبير الجيني في الخلايا الجذعية الجنينية (ES) الماوس. وتمشيا مع هذه الأدلة، أظهرت الأسفار الجيش الملكي النيبالي في الموقع التحليلات التهجين (الحمض النووي الريبي-الأسماك) فقط مجموعة فرعية من تيرا ترجمة النصوص في نهايات الكروموسومات. سوف تساعد على فهم أفضل لديناميات الجزيئات تيرا تحديد وظيفتها والآليات من العمل. هنا، نحن تصف طريقة للتسمية، وتصور telomere واحد تيرا المحاضر في الخلايا السرطانية باستخدام نظام MS2-التجارة والنقل. لتحقيق هذا الهدف، نقدم بروتوكولا لإنشاء استنساخ مستقرة، باستخدام خط خلية سرطان المعدة البشرية AGS، تحتوي على تسلسلات MS2 المتكاملة في سوبتيلوميري واحد. يؤدي النسخ تيرا من telomere MS2 معلم في التعبير عن جزيئات تيرا MS2 المعلمة التي يتم تصور بالفحص المجهري خلية يعيش الأسفار عند التعبير المشارك بروتين ملزمة رنا MS2 تنصهر للتجارة والنقل (MS2-التجارة والنقل). هذا النهج يتيح للباحثين لدراسة ديناميات telomere واحد تيرا الجزيئات في الخلايا السرطانية، ويمكن تطبيقها على خطوط الخلايا الأخرى.
Introduction
تيرا الحمض النووي الريبي فضله طويلة يتم نسخها من منطقة سوبتيلوميريك في الكروموسومات والنسخ العائدات نحو نهايات الكروموسومات، تنتهي داخل المسالك تكرار تيلوميريك1،2. لهذا السبب، تتكون من تسلسل المستمدة من سوبتيلوميريك في نهايتها 5 ‘ تيرا النصوص وإنهاء مع تكرار تيلوميريك (أوواجج في الفقاريات)3. أهمية الأدوار قد اقترحت للأرض، بما في ذلك تشكيل heterochromatin التيلومير4،5، الحمض النووي النسخ المتماثل6، تشجيع جزئ مثلى بين كروموسوم ينتهي7،8 , 9تنظيم هيكل telomere10و telomere طول التوازن2،11،،من1213. وعلاوة على ذلك، محاضر تيرا التفاعل مع العديد من المواقع اكستراتيلوميريك لتنظيم التعبير الجيني على نطاق واسع في الماوس الخلايا الجذعية الجنينية (ES)14. تمشيا مع هذه الأدلة، الأسفار الجيش الملكي النيبالي في الموقع التهجين وأظهرت تحاليل الحمض النووي الريبي (الأسماك) أن فقط مجموعة فرعية نصوص تيرا المعربة في التيلومير1،2،15. وباﻹضافة إلى ذلك، أبلغ تيرا على شكل مجاميع النووية إضفاء الطابع المحلي على الكروموسومات X و Y في الماوس الخلايا2،16. تشير هذه النتائج إلى أن النصوص تيرا الخضوع للديناميات المعقدة داخل النواة. فهم ديناميات الجزيئات تيرا سيساعد على تحديد مهمتها والآليات من العمل.
وقد استخدمت نظام MS2-التجارة والنقل على نطاق واسع لتصور جزيئات الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية من مختلف الكائنات17،18. وقد استخدمت هذا النظام سابقا الوسم ووضع تصور لجزيئات تيرا telomere واحد في12، S. cerevisiae19. باستخدام هذا النظام، فقد ظهر مؤخرا أن الخميرة تيرا النصوص المعربة داخل السيتوبلازم خلال مرحلة التحول دياوكسيك بوست، مما يوحي بأن الأرض قد تمارس مهام اكسترانوكلير20. أننا استخدمت مؤخرا نظام MS2-التجارة والنقل لدراسة النصوص تيرا telomere واحد في خلايا السرطان21. لتحقيق هذا الهدف، ونحن استخدمت أداة التحرير الجينوم كريسبر/Cas9 لدمج تسلسلات MS2 في telomere واحد (telomere 15q، يشار إليها فيما بعد Tel15q) والحصول على استنساخ معربا عن معلم MS2 تيرا Tel15q الذاتية (استنساخ تيرا-MS2). التعبير المشارك بروتين ملزمة رنا MS2 تنصهر فيها التجارة والنقل (MS2-التجارة والنقل) التي تعترف ويربط التصور تمكن تسلسل الحمض النووي الريبي MS2 telomere واحد تيرا النصوص في المعيشة الخلايا21. وغرض البروتوكول هو موضح هنا أن يصف بالتفصيل الخطوات اللازمة لتوليد الحيوانات المستنسخة تيرا-MS2.
لتوليد الحيوانات المستنسخة تيرا-MS2، تم دمج كاسيت MS2 داخل منطقة سوبتيلوميريك telomere 15q، المصب تيرا مروج المنطقة والنسخ الموقع ابدأ. كاسيت MS2 يحتوي على مورثة مقاومة النيوميسين محاط بمواقع لوكس-p، وإدماجه في سوبتيلوميري 15q تتم باستخدام نظام Cas9 كريسبر/22. بعد أن يتم تحديد تعداء MS2 استنساخ الكاسيت، واحد ويتم التحقق من التكامل سوبتيلوميريك للكاسيت ببكر، لطخة الحمض النووي تتابعها والجنوب. استنساخ إيجابية مصابون إتش معربا عن لجنة المساواة العرقية بغية إزالة علامة الاختيار في الكاسيت، تاركاً فقط MS2 متواليات وموقع واحد لوكس-ف في سوبتيلوميري 15q. يمكن التحقق منه التعبير عن النصوص تيرا MS2 معلم من Tel15q ب RT-قبكر. وأخيراً، يتم التعبير عن البروتين الانصهار MS2-التجارة والنقل في استنساخ تيرا-MS2 عبر عدوى الفيروسات الرجعية من أجل تصور النصوص تيرا MS2 بالفحص المجهري الأسفار. يمكن اكتشاف النصوص تيرا سهولة بالجيش الملكي النيبالي-الأسماك وخلية يعيش التصوير باستخدام تيلوميريك الخاصة بتكرار يسبر1،2،،من1523. هذه النهج معلومات هامة عن التعريب من مجموع السكان من جزيئات تيرا في قرار وحيد الخلية. الجيل من الحيوانات المستنسخة التي تحتوي على تسلسلات MS2 في سوبتيلوميري واحد سوف تمكن الباحثين من دراسة ديناميات telomere واحد تيرا المحاضر في الخلايا الحية، التي تساعد في تعريف الدالة وآليات عمل تيرا.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا المقال نقدم وسيلة لتوليد السرطان البشرية استنساخ الخلية التي تحتوي على تسلسلات MS2 المتكاملة داخل سوبتيلوميري 15q. استخدام هذه الحيوانات المستنسخة، الجزيئات تيرا MS2 معلم نسخها من سوبتيلوميري 15q اكتشاف بالفحص المجهري fluorescence المشارك التعبير عن البروتين الانصهار MS2-التجارة والنقل. هذا ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لموظفي مرفق التصوير المتقدم من سيبيو في بجامعة ترنتو ومرفق “بيوبتيكس الخفيفة الميكروسكوب” في واو ماكس بيروتس المختبرات (مفبل) في فيينا. البحوث المؤدية إلى هذه النتائج تلقت تمويلاً من ستيفتونغ اوبرمان مالك والبرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي للبحث والتنمية التكنولوجية ومظاهره تحت المنحة من لا 609431 للجماعة الأوروبية. تدعمه المفوضية الأوروبية على زمالة ريتا ليفي مونتالشيني من الوزارة الإيطالية للتعليم الجامعي والبحوث (وزارة).
Materials
| AGS cells | – | – | Gift from Christian Baron (Université de Montréal). |
| F12K Nut Mix 1X | GIBCO | 21127022 | Culturing medium for AGS cells |
| L-Glutamine | CORNING | MT25005CI | Component of cell culturing medium |
| Penicillin Streptomycin Solution | CORNING | 30-002-CI | Component of cell culturing medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | Component of cell culturing medium |
| DMEM 1X | GIBCO | 21068028 | culturing medium for phoenix cell |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | used in phoenix cell transfection |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X | CORNING | 59430C | used in cell split |
| DPBS 1X | GIBCO | 14190250 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO) |
| G-418 Disulphate | Formedium | G4185 | selection drug for |
| Gelatin solution Bioreagent | Sigma Aldrich | G1393 | cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate |
| Tris-base | Fisher BioReagents | 10376743 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| SDS | Sigma Aldrich | 71729 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| Proteinase K | Thermo Fisher | AM2546 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| RNAse A | Thermo Fisher | 12091021 | RNA degradation during DNA extraction |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | DNA gel preparation |
| Atlas ClearSight | Bioatlas | BH40501 | Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel |
| ethanol | Fisher BioReagents | BP28184 | DNA precipitation |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 71196 | Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2 |
| Wizard SV Gel and PCR clean-Up system | Promega | A9282 | Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones |
| Trizol | AMBION | 15596018 | Organic solvent used for RNA extraction |
| Dnase I | THERMO SCIENTIFIC | 89836 | degradation of genomic DNA from RNA |
| dNTPs mix | Invitrogen | 10297018 | used in RT and PCR reactions |
| DTT | Invitrogen | 707265ML | used in RT reactions |
| diethyl pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution) |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| MOPS | Sigma Aldrich | M9381 | preparation of RNA gel |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS) |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | Retrotranscription reaction |
| Pfu DNA polymerase (recombinant) | Thermo Scientific | EP0501 | PCR reaction |
| 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX | PCR BIOSYSTEMS | PB 20.14 | qPCR reaction |
| Cre-GFP adenovirus | https://medicine.uiowa.edu/vectorcore | 1174-HT | used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | used to promote retrovirus particles production in phoenix cells |
| PEG8000 | Sigma Aldrich | 89510 | Precipitation of retrovirus partcles |
| 35µ-Dish Glass Bottom | Ibidi | 81158 | used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones |
References
- Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
- Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
- Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
- Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
- Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).
- Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).
- Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220 (2014).
- Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
- Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
- Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
- Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
- Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).
- Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
- Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
- Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
- Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
- Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
- Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
- Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
- Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910 (2016).
- Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
- Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
- Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
- Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379 (2014).
- Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).
- Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
- Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
- Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).
