Summary

Génération de Clones de cellules de Cancer de visualiser contenant répétition télomérique RNA TERRA exprimée à partir d’un seul télomères dans les cellules vivantes

Published: January 17, 2019
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à générer des clones de cellules de cancer contenant une balise de séquence MS2 à un subtélomère unique. Cette approche, en s’appuyant sur le système de MS2-GFP, permet la visualisation des transcriptions endogènes de télomérique répétition contenant RNA (TERRA) exprimée à partir d’un seul télomères dans les cellules vivantes.

Abstract

Télomères sont transcrits, donnant lieu à télomérique contenant répéter longtemps non codantes RNAs (TERRA), qui ont été proposées à jouer un rôle important en biologie du télomère, y compris la formation de l’hétérochromatine et homéostasie longueur du télomère. Des découvertes récentes ont révélé que les molécules TERRA interagissent aussi avec les régions chromosomiques internes pour réguler l’expression génique dans les cellules souches embryonnaires (ES) de souris. Conformément à cette preuve, RNA fluorescence in situ hybridation RNA-analyses ont montré que seul un sous-ensemble de TERRA transcriptions localiser aux extrémités des chromosomes. Une meilleure compréhension de la dynamique des molécules TERRA aidera à définir leurs fonctions et mécanismes d’action. Nous décrivons ici une méthode pour étiqueter et visualiser les transcriptions TERRA single-télomères dans les cellules cancéreuses en utilisant le système de MS2-GFP. Dans ce but, nous présentons un protocole visant à générer des clones stables, à l’aide de la lignée de cellules cancéreuses humaines estomac AGS, contenant des séquences de MS2 intégrés à un subtélomère unique. Transcription de TERRA du télomère MS2-tag se traduit par l’expression de molécules TERRA MS2-tag qui sont visualisées par microscopie de fluorescence des cellules vivantes sur la co-expression d’une protéine de liaison à l’ARN MS2 fusionnée à la GFP (MS2-GFP). Cette approche permet aux chercheurs d’étudier la dynamique des molécules TERRA single-télomères dans les cellules cancéreuses, et elle peut être appliquée à d’autres lignées cellulaires.

Introduction

Le TERRA de RNA longue non codantes est transcrit à partir de la région subtélomériques des chromosomes et sa transcription se dirige vers les extrémités des chromosomes, se terminant au sein du tractus répétition télomérique1,2. Pour cette raison, transcriptions TERRA se composent de séquences subtélomériques dérivées à leur extrémité 5′ et se terminer par des répétitions télomériques (UUAGGG chez les vertébrés)3. Important de rôles ont été proposées pour TERRA, incluant la formation de l’hétérochromatine télomères4,5, DNA réplication6, promotion de la recombinaison homologue entre les chromosomes termine7,8 , 9, réglementer les télomères structure10et télomères longueur homéostasie2,11,12,13. En outre, transcriptions TERRA interagissent avec nombreux sites d’extratelomeric à réguler l’expression des gènes très répandue dans les souris de cellules souches embryonnaires (ES)14. Conformément à ces témoignages, RNA fluorescence in situ hybridation (RNA-poisson) analyses ont montré que seul un sous-ensemble des transcriptions TERRA localiser à télomères1,2,15. En outre, TERRA a été signalé pour former des agrégats nuclear localisation sur les chromosomes X et Y dans les cellules de souris2,16. Ces résultats indiquent que les transcriptions TERRA subissent une dynamique complexe dans le noyau. Comprendre la dynamique des molécules TERRA aidera à définir leurs fonctions et mécanismes d’action.

Le système MS2-GFP a été largement utilisé pour visualiser des molécules d’ARN dans les cellules vivantes de divers organismes17,18. Ce système a servi antérieurement de tag et de visualiser des molécules TERRA single-télomère dans S. cerevisiae12,19. Grâce à ce système, il a été montré récemment que les transcriptions TERRA de levure localiser dans le cytoplasme en phase post-diauxique Maj, suggérant que TERRA peut exercer des fonctions extranucléaire20. Nous avons récemment utilisé le système MS2-GFP pour étudier les transcriptions TERRA single-télomères dans les cellules de cancer du21. Dans ce but, nous avons employé l’outil d’édition du génome CRISPR/Cas9 pour intégrer des séquences MS2 à un télomère unique (télomérique 15 q, ci-après Tel15q) et clones exprimant MS2-tag endogènes Tel15q TERRA (TERRA-MS2 clones) a obtenu. La co-expression d’une protéine de liaison à l’ARN MS2 fusionnée à la GFP (MS2-GFP) qui reconnaît et se lie MS2 RNA séquences permet visualisation des transcriptions TERRA single-télomère vie cellules21. Le but du protocole illustré ici est de décrire en détail les étapes requises pour la génération de clones de TERRA-MS2.

Pour générer des clones de TERRA-MS2, une cassette de MS2 est intégrée au sein de la région subtélomériques télomérique 15 q, en aval du site TERRA de promoteur région et transcription de départ. La cassette de MS2 contient un gène de résistance de néomycine flanqué de sites de saumon fumé-p et son intégration à subtélomère 15 q est effectuée en utilisant le système CRISPR/Cas922. Après transfection de la MS2 cassette, seul les clones sont sélectionnés et subtélomériques intégration de la cassette est vérifiée par PCR, ADN, séquençage et Southern blot. Les clones positifs sont infectés par un adénovirus exprimant le Cre afin de supprimer le marqueur de sélection dans la cassette, laissant seulement les séquences MS2 et un site unique de saumon fumé-p à la subtélomère 15 q. Expression des transcriptions de MS2-tag TERRA de Tel15q est vérifiée par la RT-qPCR. Enfin, la protéine de fusion de GFP-MS2 est exprimée chez TERRA-MS2 clones par infection rétrovirale afin de visualiser les transcriptions MS2-TERRA en microscopie par fluorescence. Transcriptions TERRA peuvent être facilement détectées par RNA-poissons et imagerie de cellules vivantes avec répétition télomérique spécifiques sondes1,2,15,23. Ces approches fournissent des informations importantes sur la localisation de la population totale des molécules TERRA à résolution de cellule unique. La génération de clones contenant des séquences de MS2 à un subtélomère unique permettra aux chercheurs d’étudier la dynamique des transcriptions TERRA single-télomères dans les cellules vivantes, qui aideront à définir la fonction et les mécanismes d’action de TERRA.

Protocol

1. Sélection des Clones résistants néomycine La croissance de cellules AGS dans le milieu F-12_K du jambon (Kaighn) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (SVF), 2 mM de L-glutamine, pénicilline (0,5 unités par mL de milieu) et la streptomycine (0,2 µg / mL de milieu) à 37 ° C et 5 % de CO2. Transfecter les cellules à une confluence de 50-60 % avec le sgRNA/Cas9 exprimant le vecteur et la cassette de MS2 à un 01:10 rapport molaire21.Remarque : Dans une expé…

Representative Results

Figure 1 représente une vue d’ensemble de la stratégie expérimentale. Les principales étapes du protocole et un calendrier indicatif pour la génération de TERRA-MS2 clones dans les cellules AGS apparaissent (Figure 1A). Au jour 1, plusieurs puits d’une plaque 6 puits sont transfectées avec la cassette de MS2 et sgRNA/Cas9 exprimant des vecteurs (illustrés à la Figure <stron…

Discussion

Dans cet article, nous présentons une méthode pour générer des clones de cellules cancéreuses humaines contenant des séquences de MS2 intégrées au sein de subtélomère 15 q. À l’aide de ces clones, les molécules TERRA MS2-tag transcrits à partir de la subtélomère 15 q sont détectés par microscopie de fluorescence par co-expression d’une protéine de fusion de GFP-MS2. Cette approche permet aux chercheurs d’étudier la dynamique de TERRA exprimée à partir d’un seul télomère vie cellules<sup cla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants envers le personnel de l’installation d’imagerie avancée de CIBIO à l’Université de Trento et le BioOptics Light Microscopy facility à laboratoires de Perutz pour le F. Max (MFPL) à Vienne. La recherche ayant abouti à ces résultats a reçu un financement de la Stiftung Mahlke-Obermann et septième Programme-cadre pour la recherche, de développement technologique et de démonstration de l’Union européenne en vertu de la convention de subvention sans 609431 à EC. EC est soutenu par une bourse de Rita Levi Montalcini du ministère italien de l’enseignement universitaire et la recherche (MIUR).

Materials

AGS cells Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1X GIBCO 21127022 Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine  CORNING MT25005CI Component of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin Solution CORNING 30-002-CI Component of cell culturing medium
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 Component of cell culturing medium
DMEM 1X GIBCO 21068028 culturing medium for phoenix cell
CaCl2 Sigma Aldrich C1016 used in phoenix cell transfection
HEPES Sigma Aldrich H3375 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KCl Sigma Aldrich P9333 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
Dextrose Sigma Aldrich D9434 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaCl Sigma Aldrich S7653 used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4 Sigma Aldrich S3264 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X CORNING 59430C used in cell split
DPBS 1X GIBCO 14190250 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSO Sigma Aldrich D8418 Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 Disulphate Formedium G4185 selection drug for 
Gelatin solution Bioreagent Sigma Aldrich G1393 cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-base Fisher BioReagents 10376743 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTA Sigma Aldrich E6758 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDS Sigma Aldrich 71729 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase K Thermo Fisher AM2546 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse A Thermo Fisher 12091021 RNA degradation during DNA extraction
Agarose Sigma Aldrich A5304 DNA gel preparation
Atlas ClearSight Bioatlas BH40501 Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanol Fisher BioReagents BP28184 DNA precipitation
Sodium Acetate  Sigma Aldrich 71196 Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up system Promega A9282 Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
Trizol AMBION 15596018 Organic solvent used for RNA extraction
Dnase I THERMO SCIENTIFIC 89836 degradation of genomic DNA from RNA 
dNTPs mix Invitrogen 10297018 used in RT and PCR reactions
DTT Invitrogen 707265ML used in RT reactions
diethyl pyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
Ribolock Thermo Fisher EO0381 RNase inhibitor
MOPS Sigma Aldrich M9381 preparation of RNA gel
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen 18080-093 Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant) Thermo Scientific EP0501 PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX PCR BIOSYSTEMS PB 20.14 qPCR reaction
Cre-GFP adenovirus https://medicine.uiowa.edu/vectorcore 1174-HT used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887 used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000 Sigma Aldrich 89510 Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass Bottom Ibidi 81158 used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones

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Avogaro, L., Oss Pegorar, C., Bettin, N., Cusanelli, E. Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells. J. Vis. Exp. (143), e58790, doi:10.3791/58790 (2019).

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