Génération de Clones de cellules de Cancer de visualiser contenant répétition télomérique RNA TERRA exprimée à partir d’un seul télomères dans les cellules vivantes
Summary
Nous présentons ici un protocole visant à générer des clones de cellules de cancer contenant une balise de séquence MS2 à un subtélomère unique. Cette approche, en s’appuyant sur le système de MS2-GFP, permet la visualisation des transcriptions endogènes de télomérique répétition contenant RNA (TERRA) exprimée à partir d’un seul télomères dans les cellules vivantes.
Abstract
Télomères sont transcrits, donnant lieu à télomérique contenant répéter longtemps non codantes RNAs (TERRA), qui ont été proposées à jouer un rôle important en biologie du télomère, y compris la formation de l’hétérochromatine et homéostasie longueur du télomère. Des découvertes récentes ont révélé que les molécules TERRA interagissent aussi avec les régions chromosomiques internes pour réguler l’expression génique dans les cellules souches embryonnaires (ES) de souris. Conformément à cette preuve, RNA fluorescence in situ hybridation RNA-analyses ont montré que seul un sous-ensemble de TERRA transcriptions localiser aux extrémités des chromosomes. Une meilleure compréhension de la dynamique des molécules TERRA aidera à définir leurs fonctions et mécanismes d’action. Nous décrivons ici une méthode pour étiqueter et visualiser les transcriptions TERRA single-télomères dans les cellules cancéreuses en utilisant le système de MS2-GFP. Dans ce but, nous présentons un protocole visant à générer des clones stables, à l’aide de la lignée de cellules cancéreuses humaines estomac AGS, contenant des séquences de MS2 intégrés à un subtélomère unique. Transcription de TERRA du télomère MS2-tag se traduit par l’expression de molécules TERRA MS2-tag qui sont visualisées par microscopie de fluorescence des cellules vivantes sur la co-expression d’une protéine de liaison à l’ARN MS2 fusionnée à la GFP (MS2-GFP). Cette approche permet aux chercheurs d’étudier la dynamique des molécules TERRA single-télomères dans les cellules cancéreuses, et elle peut être appliquée à d’autres lignées cellulaires.
Introduction
Le TERRA de RNA longue non codantes est transcrit à partir de la région subtélomériques des chromosomes et sa transcription se dirige vers les extrémités des chromosomes, se terminant au sein du tractus répétition télomérique1,2. Pour cette raison, transcriptions TERRA se composent de séquences subtélomériques dérivées à leur extrémité 5′ et se terminer par des répétitions télomériques (UUAGGG chez les vertébrés)3. Important de rôles ont été proposées pour TERRA, incluant la formation de l’hétérochromatine télomères4,5, DNA réplication6, promotion de la recombinaison homologue entre les chromosomes termine7,8 , 9, réglementer les télomères structure10et télomères longueur homéostasie2,11,12,13. En outre, transcriptions TERRA interagissent avec nombreux sites d’extratelomeric à réguler l’expression des gènes très répandue dans les souris de cellules souches embryonnaires (ES)14. Conformément à ces témoignages, RNA fluorescence in situ hybridation (RNA-poisson) analyses ont montré que seul un sous-ensemble des transcriptions TERRA localiser à télomères1,2,15. En outre, TERRA a été signalé pour former des agrégats nuclear localisation sur les chromosomes X et Y dans les cellules de souris2,16. Ces résultats indiquent que les transcriptions TERRA subissent une dynamique complexe dans le noyau. Comprendre la dynamique des molécules TERRA aidera à définir leurs fonctions et mécanismes d’action.
Le système MS2-GFP a été largement utilisé pour visualiser des molécules d’ARN dans les cellules vivantes de divers organismes17,18. Ce système a servi antérieurement de tag et de visualiser des molécules TERRA single-télomère dans S. cerevisiae12,19. Grâce à ce système, il a été montré récemment que les transcriptions TERRA de levure localiser dans le cytoplasme en phase post-diauxique Maj, suggérant que TERRA peut exercer des fonctions extranucléaire20. Nous avons récemment utilisé le système MS2-GFP pour étudier les transcriptions TERRA single-télomères dans les cellules de cancer du21. Dans ce but, nous avons employé l’outil d’édition du génome CRISPR/Cas9 pour intégrer des séquences MS2 à un télomère unique (télomérique 15 q, ci-après Tel15q) et clones exprimant MS2-tag endogènes Tel15q TERRA (TERRA-MS2 clones) a obtenu. La co-expression d’une protéine de liaison à l’ARN MS2 fusionnée à la GFP (MS2-GFP) qui reconnaît et se lie MS2 RNA séquences permet visualisation des transcriptions TERRA single-télomère vie cellules21. Le but du protocole illustré ici est de décrire en détail les étapes requises pour la génération de clones de TERRA-MS2.
Pour générer des clones de TERRA-MS2, une cassette de MS2 est intégrée au sein de la région subtélomériques télomérique 15 q, en aval du site TERRA de promoteur région et transcription de départ. La cassette de MS2 contient un gène de résistance de néomycine flanqué de sites de saumon fumé-p et son intégration à subtélomère 15 q est effectuée en utilisant le système CRISPR/Cas922. Après transfection de la MS2 cassette, seul les clones sont sélectionnés et subtélomériques intégration de la cassette est vérifiée par PCR, ADN, séquençage et Southern blot. Les clones positifs sont infectés par un adénovirus exprimant le Cre afin de supprimer le marqueur de sélection dans la cassette, laissant seulement les séquences MS2 et un site unique de saumon fumé-p à la subtélomère 15 q. Expression des transcriptions de MS2-tag TERRA de Tel15q est vérifiée par la RT-qPCR. Enfin, la protéine de fusion de GFP-MS2 est exprimée chez TERRA-MS2 clones par infection rétrovirale afin de visualiser les transcriptions MS2-TERRA en microscopie par fluorescence. Transcriptions TERRA peuvent être facilement détectées par RNA-poissons et imagerie de cellules vivantes avec répétition télomérique spécifiques sondes1,2,15,23. Ces approches fournissent des informations importantes sur la localisation de la population totale des molécules TERRA à résolution de cellule unique. La génération de clones contenant des séquences de MS2 à un subtélomère unique permettra aux chercheurs d’étudier la dynamique des transcriptions TERRA single-télomères dans les cellules vivantes, qui aideront à définir la fonction et les mécanismes d’action de TERRA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous présentons une méthode pour générer des clones de cellules cancéreuses humaines contenant des séquences de MS2 intégrées au sein de subtélomère 15 q. À l’aide de ces clones, les molécules TERRA MS2-tag transcrits à partir de la subtélomère 15 q sont détectés par microscopie de fluorescence par co-expression d’une protéine de fusion de GFP-MS2. Cette approche permet aux chercheurs d’étudier la dynamique de TERRA exprimée à partir d’un seul télomère vie cellules<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants envers le personnel de l’installation d’imagerie avancée de CIBIO à l’Université de Trento et le BioOptics Light Microscopy facility à laboratoires de Perutz pour le F. Max (MFPL) à Vienne. La recherche ayant abouti à ces résultats a reçu un financement de la Stiftung Mahlke-Obermann et septième Programme-cadre pour la recherche, de développement technologique et de démonstration de l’Union européenne en vertu de la convention de subvention sans 609431 à EC. EC est soutenu par une bourse de Rita Levi Montalcini du ministère italien de l’enseignement universitaire et la recherche (MIUR).
Materials
| AGS cells | – | – | Gift from Christian Baron (Université de Montréal). |
| F12K Nut Mix 1X | GIBCO | 21127022 | Culturing medium for AGS cells |
| L-Glutamine | CORNING | MT25005CI | Component of cell culturing medium |
| Penicillin Streptomycin Solution | CORNING | 30-002-CI | Component of cell culturing medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | Component of cell culturing medium |
| DMEM 1X | GIBCO | 21068028 | culturing medium for phoenix cell |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | used in phoenix cell transfection |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X | CORNING | 59430C | used in cell split |
| DPBS 1X | GIBCO | 14190250 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO) |
| G-418 Disulphate | Formedium | G4185 | selection drug for |
| Gelatin solution Bioreagent | Sigma Aldrich | G1393 | cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate |
| Tris-base | Fisher BioReagents | 10376743 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| SDS | Sigma Aldrich | 71729 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| Proteinase K | Thermo Fisher | AM2546 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| RNAse A | Thermo Fisher | 12091021 | RNA degradation during DNA extraction |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | DNA gel preparation |
| Atlas ClearSight | Bioatlas | BH40501 | Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel |
| ethanol | Fisher BioReagents | BP28184 | DNA precipitation |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 71196 | Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2 |
| Wizard SV Gel and PCR clean-Up system | Promega | A9282 | Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones |
| Trizol | AMBION | 15596018 | Organic solvent used for RNA extraction |
| Dnase I | THERMO SCIENTIFIC | 89836 | degradation of genomic DNA from RNA |
| dNTPs mix | Invitrogen | 10297018 | used in RT and PCR reactions |
| DTT | Invitrogen | 707265ML | used in RT reactions |
| diethyl pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution) |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| MOPS | Sigma Aldrich | M9381 | preparation of RNA gel |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS) |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | Retrotranscription reaction |
| Pfu DNA polymerase (recombinant) | Thermo Scientific | EP0501 | PCR reaction |
| 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX | PCR BIOSYSTEMS | PB 20.14 | qPCR reaction |
| Cre-GFP adenovirus | https://medicine.uiowa.edu/vectorcore | 1174-HT | used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | used to promote retrovirus particles production in phoenix cells |
| PEG8000 | Sigma Aldrich | 89510 | Precipitation of retrovirus partcles |
| 35µ-Dish Glass Bottom | Ibidi | 81158 | used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones |
References
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